李红胜 宁瑶 衡翔 李胜兵 陈松劲 叶俏
[摘要] 意图 研讨miRNA-181a检测在系统性红斑狼疮患者临床诊治中的价值。 办法 选用反转录PCR法（RT-PCR）检测36例2015年1～6月来我院门诊和住院就诊的系统性红斑狼疮（SLE）患者及30例同期来我院健康体检的对照者的血浆miRNA-181a相对表达量，一起测定SLE患者的血沉（ESR）、C反响蛋白（CRP）与免疫球蛋白IgG、IgA、IgM和补体C3、C4及系统性红斑狼疮活动指数（SLEDAI）等，剖析miRNA-181a与这些临床目标的联系。 成果 SLE组miRNA-181a相对表达水平显着高于健康对照组，SLE活动期组高于SLE稳定时组，差异均有统计学含义（P<0.05）。SLE患者血浆miRNA-181a相对表达水平与血沉、C反响蛋白、SLEDAI评分等呈正相关（r=0.48、0.56、0.62，P均<0.05）。 定论 血浆miRNA-181a浓度在SLE患者体内显着升高，且与SLE患者现在常用的一些临床点评目标高度相关，miRNA-181a有可能成为一个新的SLE疾病活动度点评及预后判别的分子标志物。
[要害词] miRNA-181a；血浆；系统性红斑狼疮；临床目标；反转录PCR
[中图分类号] R593.241 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）32-0037-04
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种本身免疫介导的以免疫性炎症为突出表现、常累及多系统、多器官的本身免疫性疾病。SLE病因杂乱，发病机制尚不清晰，机体的免疫异常被认为是发病的要害原因。细小RNA（microRNA，miRNA）是一类广泛存在于真核生物中、长度约21～25个核苷酸的非编码小分子RNA。它可经过与靶基因mRNA序列的特异性彼此效果降解mRNA或按捺靶基因的翻译，还可在特定条件下上调靶基因的蛋白表达和mRNA水平。研讨标明，在本身免疫性疾病的发作与开展进程中，microRNA发挥着不行忽视的效果[1]。
本研讨选用实时荧光定量PCR法检测36例SLE患者和30例健康人群血浆的miRNA-181a相对表达量，并一起检测SLE患者血沉（ESR）、C反响蛋白（CRP）、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM和补体C3、C4及系统性红斑狼疮活动指数（SLEDAI）等，剖析miRNA-181a水平与这些临床目标的联系，评论miRNA-181a在SLE疾病中的临床价值。
1 材料与办法
1.1 一般材料
挑选2015年1～6月来我院门诊和住院就诊的SLE患者36例，SLE确诊均契合1997年美国风湿病学会修订的SLE确诊攻略，扫除患有其他全身性疾病的患者。其间男7例，女29例，年纪23～61岁，均匀（37±9）岁。系统性红斑狼疮活动指数（SLEDAI）≥6（活动期）21例，SLEDAI<6（稳定时）15例；别的选取来我院健康体检正常的30例人群作为对照人群（正常对照组），扫除有高血压、心脏病、糖尿病、本身免疫性疾病及其他疾病者，不得具有SLE确诊规范中的任何一条。其间男5例，女25例，年纪21～57岁，均匀年纪（36±7）岁，两组间年纪、性别等差异无统计学含义。患者进入研讨后即对患者进行全面的查看并依据查看状况核算其SLEDAI评分[2]。血沉的检测选用魏氏法，C反响蛋白与免疫球蛋白IgG、、IgA、IgM和补体C3、C4的检测均在Beckman coulter Immage 800上进行。本研讨得到了嘉兴市第二医院医学道德委员会的赞同，一切受试目标均知情赞同。
1.2 仪器与试剂
实时荧光定量PCR仪Roche Cobas Z 480购自美国Roche公司，Eppendorf D30紫外分光光度计购自Eppendorf公司，PCR引物由上海生工组成，Trizol RNA提取试剂、BIOGHC Elitefast SYBR Kit及BIOG Super Reverse Transcriptase均购自Invitrogell公司。
1.3实验办法
1.3.1 标本处理 取SLE患者静脉血2 mL置于EDTA抗凝管中，800 g离心10 min后汲取上清血浆至1.5 mL EP管中，再次800 g离心10 min，取上清血浆-80℃冷冻保存，一致检测。正常对照组标本处理同前。
1.3.2 总RNA的提取与纯化 用 Trizol RNA提取试剂盒提取和纯化总RNA，按试剂说明书操作。使用Eppendor D30紫外分光光度仪检测总RNA 浓度和质量，检测合格者置-80℃冰箱冻存待用。
1.3.3 miRNA-181a的反转录 使用BIOG Super Reverse Transcriptase对提取的总RNA中miRNA反转录成cDNA。按说明书将总RNA 5 μL参加反响系统，miRNA-181a反转录反响条件：25℃ 5 min，42℃ 15 min，85℃ 5 min；转录后得到的cDNA进行real-time PCR或-20℃保存备用。
1.3.4 Real-time PCR 在Cobas Z 480 PCR仪器上进行qRT-PCR。以小分子RNA U6作为内参，所用引物序列见表1。反响系统：cDNA 模板2 μL，2×BIOGHC Elitefast SYBR Master mix 10 μL，Primer Set 0.8 μL，加 RNase free ddH2O至20 μL。反應条件：95℃ 5 min一个循环，95℃ 10 sec，60℃ 30 sec共40个循环，溶解曲线一个循环。实验重复3次，核算各标本均匀Ct值。miRNA-181a的相对含量以2-ΔΔCt表明[3]，ΔΔCt=实验组ΔCt（意图基因 Ct-内参基因 Ct）-对照组ΔCt（意图基因Ct-内参基因Ct）。
1.4 统计学办法
选用SPSS18.0软件进行统计剖析。计量材料以（x±s）表明，组间比较选用t查验，miRNA-181a的表达量与SLE临床目标的相关性选用pearson相关性剖析，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 SLE组和正常对照组血浆中miRNA-181a相对表达量比较
Real-Time PCR检测成果显现，SLE组miRNA-181a的相对表达量（0.68±0.19）显着高于对照组（0.41±0.15），差异有统计学含义（t=3.26，P=0.02<0.05）。
2.2 SLE患者血浆中miRNA-181a相对表达量与一些常用临床目标的相关性
SLE活动期患者外周血浆中的miRNA-181a相对表达量显着高于稳定时患者，差异有统计学含义（t=4.13，P<0.01）（图1）。相关性剖析成果显现：SLE患者miRNA-181a相对表达水平与SLEDAI积分呈正相关（r=0.62，P=0.043）（图2），与患者的ESR、CRP也呈正相关（r=0.48、0.56、P均<0.05）（图3，图4），与患者的年纪、性别、补体C3、C4水平无相关性（P均>0.05）。
3 评论
miRNA-181作为micro-RNAs的一个宗族系列，首要有miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d[4]。在人类中，miRNA-181首要在3个独立的染色体上编码，miRNA-181a-1/b-1坐落1号染色体上，miRNA-181a-2/b-2坐落9号染色体上，miRNA-181c/d坐落19号染色体上[5]。miRNA-181宗族成员的首要效果机制是经过与靶标mRNA的3-UTR碱基互补结合，按捺其下一步的翻译功用，或许下降其互补mRNA的稳定性，到达调控相关基因的表达，进而参加各种生理或病理进程效果。miRNA宗族成员在基因的功用上并不完全相同[6]，miRNA-181a作为miRNA-181宗族中重要一员，在細胞的开展和分解进程中起着尤为重要的效果，它可以按捺多种细胞增殖并促进细胞凋亡，且在不同组织细胞中具有表达差异[7，8]，研讨发现其在癌症和本身免疫性疾病中常常出现异常高表达或低表达[9]。
系统性红斑狼疮作为一种缓慢的多器官的本身免疫性疾病[10]，有多种临床表现型，病程活动期与稳定时呈拖延重复替换出现，严重者可导致逝世。在其开展进程中有多种炎症因子参加其间，如TNF-α、IL-1、IL-6和IFN等，这些炎症因子经过MAPK通路发挥效果[11]。在该病的发作和开展进程中，miRNA-181家庭均发挥着重要效果[12，13]。
关于miRNA-181a表达水平与SLE疾病的相关性现在有一些彼此对立的研讨成果[9，13-15]，咱们使用RT-PCR办法检测了SLE患者血浆中miRNA-181a相对表达水平，成果发现SLE患者血浆中miRNA-181a相对表达水平显着高于正常对照组（P<0.05），且SLE活动期患者血浆中miRNA-181a相对表达水平显着高于SLE稳定时患者（P<0.05），这与Carlsen AL[13]、Motawi TK[14]等的研讨成果相同。MiRNA-181a表达水平与SLE疾病的相关性可能与miRNA-181a参加调控体内的炎症反响有关。研讨发现miRNA-181a可以调理IL-8、IL-1α、IL-1β和IL-6等的表达，进而调理炎症反响[16，17]。其对 IL-8和 IL-1α的表达调控均出现出反向调理的联系，而对 IL-1β和IL-6 的调控则是正向调控。其可能经过TLR-4通路对这些炎症因子的表达进行调控[17]。
本研讨还剖析了SLE患者血浆中miRNA-181a相对表达水平与一些常见临床病理特征之间的联系，SLE患者血浆中miRNA-181a相对表达水平凹凸与患者年纪、性别、补体C3、C4浓度均无显着相关（P>0.05），miRNA-181a水平与SLEDAI积分、ESR、CRP呈正相关（P<0.05），提示miRNA-181a可能与SLE疾病的临床活动度及预后有关，但这需求进一步扩展样本量，一起进行长时间随访研讨。有研讨提示SLE发病年纪对临床疾病的出现方法、器官劳累的形式以及血清学查看成果都会有不同影响[18-20]，这可能会导致miRNA-181a相对表达量与临床目标联系在成人SLE患者与儿童SLE患者之间有所不同。本实验没有对儿童SLE患者进行相关研讨。现在对miRNA-181a效果靶标的辨别验证以及其怎么导致靶标mRNAs缄默沉静的机制还需进一步的探究研讨。
综上所述，在SLE患者血浆中miRNA-181a的浓度增高，且与疾病的活动度相关，跟着对miRNA-181a研讨的不断深入，miRNA-181a有可能成为SLE前期确诊、临床活动度点评及预后判别的新的分子标志物。
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（收稿日期：2016-08-24）
