朱喆 高国生 柯叶芳
[摘要] 意图 评论血清ADAMTSL-1蛋白检测在缓慢肝病中的临床含义。 办法 搜集2016年2～4月在宁波市第二医院肝病中心就诊的80例缓慢肝病患者作为试验组，依据Child-Pugh评分分为A级32例，B级30例，C级18例，别的挑选24例健康体检者作为正常对照组。检测各组人群血清中的ADAMTSL-1蛋白浓度，并进行统计学剖析。 成果 缓慢肝病患者的血清ADAMTSL-1蛋白浓度为10.93（9.43～16.36）ng/mL，显着高于正常对照组的7.53（6.91～8.17）ng/mL（t=5.47，P<0.01）；缓慢肝病患者血清ADAMTSL-1蛋白浓度跟着Child-Pugh评分的升高而添加（F=12.33，P<0.01）。 定论 血清ADAMTSL-1蛋白有可能成为反映缓慢肝病患者肝脏储藏功用的新目标。
[关键词] ADAMTSL-1；ADAMTS宗族；凝血酶灵敏蛋白-1；缓慢肝病；Child-Pugh评分
[中图分类号] R575 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2016）36-0128-04
[Abstract] Objective To investigate the clinical significance of serum ADAMTSL-1 in chronic liver disease. Methods 80 cases of patients with chronic liver disease admitted to Liver Disease Center in Ningbo No.2 Hospital from February to April 2016 were collected as the experimental group. There were 32 cases of grade A， 30 cases of grade B and 18 cases of grade C according to the Child-Pugh score. In addition， 24 healthy subjects were selected as normal control group. The serum concentration of ADAMTSL-1 protein in each group was detected and analyzed statistically. Results The serum ADAMTSL-1 protein concentration in patients with chronic liver disease was 10.93（9.43-16.36） ng/mL， which was significantly higher than 7.53（6.91-8.17） ng/mL in the control group（t=5.47， P<0.01）. The serum ADAMTSL-1 protein concentration increased with the Child-Pugh score in chronic liver disease patients（F=12.33， P<0.01）. Conclusion Serum ADAMTSL-1 protein may be a new indicator of hepatic reserve function in patients with chronic liver disease.
[Key words] ADAMTSL-1； ADAMTS family； Thrombin sensitive protein-1； Chronic liver diseases； Child-Pugh score
含凝血酶灵敏蛋白-1（TSP-1）重復基序的解聚素样金属蛋白酶超宗族（ADAMTS super family）包含19种不同的ADAMTS蛋白和至少7种ADAMTS-like（ADAMTSL）蛋白[1]。ADAMTSL除不具有金属蛋白酶和解聚素样结构域外，含有其他ADAMTS的结构域，包含TSP-1。ADAMTSL没有蛋白酶活性，且功用不知道，其间一些成员被以为是细胞外基质（EMC）的组成成分[2]。
ADAMTSL-1是该宗族的首个成员，是一类排泄性糖蛋白，因其在细胞外基质的散布呈颗粒状而被称为punctin-1[3]。ADAMTSL-1含有4个TSP-1，TSP-1与激活TGF-β联系密切[4]，而TGF-β又与肝病的发作开展相关[5，6]，但现在尚无ADAMTSL-1是否参加肝病开展的相关报导。本文以不同程度（Child-Pugh A、B、C）缓慢肝病患者为研讨目标，检测血清中ADAMTSL-1蛋白浓度，评论血清ADAMTSL-1蛋白在缓慢肝病中的临床价值。
1 材料与办法
1.1 一般材料
接连搜集2016年2～4月在宁波市第二医院肝病中心就诊的各种原因所造成的的缓慢肝病患者80例作为试验组，男50例，女30例，平均年纪（57.49±12.66）岁。一切患者确诊规范依据中华医学会2000年制定的《病毒性肝炎防治计划》，其间，缓慢HBV感染者63例，缓慢HCV感染者2例，酒精性肝炎/肝硬化9例，药物性肝炎/肝硬化6例。扫除规范：（1）确诊或可疑恶性肿瘤；（2）妊娠；（3）兼并 HIV感染。依据入院时患者的肝性脑病状况、腹水的有无及其程度、血清总胆红素、血清白蛋白和凝血酶原时刻（PT）将肝脏储藏功用分为Child-Pugh A、B、C三级（5～6分为A级，7～9分为B级，10～15分为C级），其间A级32例，B级30例，C级18例。另选取24例无肝胆疾病的健康体检者作为对照组，其间男16例，女8例，平均年纪（57.21±11.45）岁。试验组和对照组的性别和年纪具有可比性。本研讨由宁波市第二医院道德委员会同意，一切研讨目标均签署知情同意书。
1.2 检测办法
对一切患者和健康对照组收集5 mL全血标本，1000 g离心15 min后，取上清液并置于-80℃保存。试验前，一切标本室温下复溶后再次离心以备检测。ADAMTSL-1 ELISA试剂盒购自美国Cusabio公司，试剂批号：B24012221。酶标仪型号为德国西门子BEP-Ⅲ。选用生物素-亲和素扩大的ELISA（BA-ELISA）检测血清中的ADAMTSL-1蛋白。在预包被抗ADAMTSL-1抗体的微孔板中参加待测血清和规范品，再顺次参加生物素化的抗ADAMTSL-1抗体和HRP符号亲和素，最终经底物显色，并在450 nm波长下测定OD值。依据规范曲线求得待测血清ADAMTSL-1浓度。具体操作过程见试剂说明书。
1.3 统计学处理
ADAMTSL-1浓度为呈偏态散布的计量材料，故用中位数（四分位数）标明，两组和多组均数的比较选用t查验和方差剖析（经开平方正态性变换后）。选用SPSS16.0软件剖析数据，双侧查验P<0.05标明差异有统计学含义。
2成果
2.1 缓慢肝病患者和正常对照组血清ADAMTSL-1蛋白比较
80例缓慢肝病患者的血清ADAMTSL-1蛋白浓度为10.93（9.43～16.36）ng/mL，显着高于正常对照组的7.53（6.91～8.17）ng/mL（t=5.47，P<0.01）。
2.2血清ADAMTSL-1蛋白在不同Child-Pugh 评分缓慢肝病中的比较
血清ADAMTSL-1蛋白浓度跟着Child-Pugh评分的升高而添加（F=12.33，P<0.01），经LSD查验，Child-Pugh 评分A、B、C级之间的差异均有统计学含义（P均<0.05）。见图1。
3评论
到现在为止，已有多个ADAMTS超宗族中的成员被发现与肝病开展相关。ADAMTS13是肝脏排泄的一种金属蛋白酶，首要由肝星状细胞组成，其效果是经过降解vWF多聚体削减血栓的构成[7]。Uemura等[8]以为跟着肝脏功用的减退ADAMTS13活性和抗原含量逐渐下降。而Wiese等[9]的研讨发现肝硬化患者的ADAMTS13蛋白含量显着高于对照组，但与Child-Pugh评分、门脉高压和血流动力学无关。以上两项研讨的定论看似对立，其原因可能与前者研讨目标大多为病毒性肝炎肝硬化且收集的血标本为来自外周静脉，而后者病例大多为酒精性肝硬化且血液收集自肝静脉和股动脉有关。还有研讨指出缓慢乙型和丙型肝炎患者血浆中ADAMTS13活性和含量的升高是开展成肝癌的风险要素[10]。ADAMTS-2、ADAMTS-3和 ADAMTS-14是前胶原N端蛋白酶，可经过剪切N结尾前肽使前胶原开展为老练胶原；三者都可经过裂解转化因子结合蛋白1（Latent TGF-βbinding protein1，LTBP1）、TGF-β受体Ⅲ和前TGF-β而起到调理TGF-β信号的效果[11]。李汉军等[12]也经过免疫组化和Western blot检测到ADAMTS-2和TGF-β1在肝硬化安排中的表达比正常肝安排显着升高，然后估测两者可能存在协同致肝纤维化效果。
在曩昔的研讨中发现ADAMTSL蛋白并不是由ADAMTS基因的剪接变体所发作的，它们由独立的基因编码，如ADAMTSL-1编码基因坐落人类染色体9p21-22[3]，ADAMTSL-3编码基因坐落人类染色体15等[13]。ADAMTSL-1蛋白含有497个氨基酸，含有1个信号肽、4个TSP-1、1个半胱氨酸富集区域、1个距离区域和1个N-衔接糖基化位点。研讨指出ADAMTSL-1蛋白的TSP-1中含有O-衔接岩藻糖基化位点和C-甘露糖基化位点，按捺两者糖基化会削减ADAMTSL-1蛋白的排泄。由此估测O-衔接岩藻糖基化和C-甘露糖基化可能作为翻译后润饰而影响该蛋白的生成[2，14]。ADAMTSL-1蛋白首要表达在骨骼肌，而其小信使RNA也可见于其他安排（如心脏、结肠、肾脏、肝脏）[3]。Campbell等[15]通過对小鼠骨肉瘤模型打针Hh通路按捺剂IPI-926削弱骨肉瘤的增殖，一起发现ADAMTSL-1表达下降，以为ADAMTSL-1可能作为Hh通路的调控基因改变了骨肉瘤的开展。在秀丽隐杆线虫中，与哺乳动物ADAMTSL-1同源的MADD-4经过导素受体UNC-40/DCC发挥效果[16]。DCC与细胞凋亡和肿瘤构成相关[17，18]，由此也估测ADAMTSL-1参加了肿瘤的发作开展。
到现在为止，包含ADAMTSL-1在内的ADAMTSL蛋白宗族功用依然不知道，特别是其与缓慢肝病的联系未见有报导。Hirohata等[3]以为这类蛋白可能经过竞赛ADAMTS的底物而表现出与ADAMTS蛋白相拮抗。Drechsler等[19]在黑腹果蝇中发现与ADAMTSL同源的Loh可经过与Prc胶原结合而在心肌的细胞外基质构成过程中起关键效果，标明ADAMTSL在进化过程中十分保存，并可能经过与胶原的结合而参加细胞外基质的构成。另一方面，已发现多种ADAMTSL基因突变与疾病相关，如ADAMTSL-4基因突变被以为是常染色体隐性的孤立性晶状体异位（autosomal recessive isolated ectopialentis，IEL）的首要要素[20]；而ADAMTSL-2基因突变与一种表现为身材矮小、指短、皮厚和心瓣膜反常的稀有肌发育不良（geleophysic dysplasia）有关[21]。
原纤蛋白-1（fibrillin-1）是组成细胞外基质的首要成分，与TGF-β联系密切，而后者又是肝硬化最相关的细胞因子。TGF-β可促进原纤蛋白1的表达，而原纤蛋白1参加构成的LTBPs又是活性TGF-β的重要来历[22，23]。ADAMTSL-2、3、6已被发现能够与原纤蛋白1结合，是构成微纤维的重要调理分子[24，25]。Hubmccher等[24]以为ADAMTSL蛋白可能参加了TGF-β的信号通路，提示咱们值得对ADAMTSL宗族做进一步的研讨。
在本研讨中，咱们发现缓慢肝病患者血清中ADAMTSL-1的浓度显着高于健康对照组，且跟着Child-Pugh评分的添加而升高，各级之间存在着显着性差异，标明ADAMTSL-1蛋白可能参加缓慢肝病的开展。但是本研讨也存在必定的缺点，如（1）病例数较少，尤其是Child-Pugh评分B、C级的患者数量缺乏；（2）因样本数量的约束未能研讨该蛋白与肝癌的相关性。所以未来的研讨中咱们需进行大样本量试验，并将肝癌患者归入研讨，或许ADAMTSL-1蛋白能成为反映缓慢肝病患者肝脏储藏功用和预后的新目标。
[参考文献]
[1] Le Goff C，Cormier-Daire V. The ADAMTS（L）family and human genetic disorders[J]. Hum Mol Genet，2011，20（R2）：R163-167.
[2] Wang LW，Dlugosz M，Somerville RP，et al. O-fucosylation of thrombospondin type 1 repeats in ADAMTS-like-1/punctin-1 regulates secretion：Implications for the ADAMTS superfamily[J]. J Biol Chem，2007，282（23）：17024-17031.
[3] Hirohata S，Wang LW，Miyagi M，et al. Punctin，a novel ADAMTS-like molecule，ADAMTSL-1，in extracellular matrix[J]. J Biol Chem，2002，277（14）：12182-12189.
[4] Breitkopf K，Sawitza I，Westhoff JH，et al. Thrombospondin 1 acts as a strong promoter of transforming growth factor beta effects via two distinct mechanisms in hepatic stellate cells[J]. Gut，2005，54（5）：673-681.
[5] Yang L，Roh YS，Song J，et al. Transforming growth factor beta signaling in hepatocytes participates in steatohepatitis through regulation of cell death and lipid metabolism in mice[J]. Hepatology，2014，59（2）：483-495.
[6] Giannelli G，Mikulits W，Dooley S，et al. The rationale for targeting TGF-beta in chronic liver diseases[J]. Eur J Clin Invest，2016，46（4）：349-361.
[7] Uemura M，Tatsumi K，Matsumoto M，et al. Localization of ADAMTS13 to the stellate cells of human liver[J]. Blood，2005，106（3）：922-924.
[8] Uemura M，Fujimura Y，Matsumoto M，et al. Comprehensive analysis of ADAMTS13 in patients with liver cirrhosis[J]. Thromb Haemost，2008，99（6）：1019-1029.
[9] Wiese S，Timm A，Nielsen LB，et al. Plasma ADAMTS-13 protein is not associated with portal hypertension or hemodynamic changes in patients with cirrhosis[J]. Dig Liver Dis，2016，48（4）：404-408.
[10] Ikeda H，Tateishi R，Enooku K，et al. Prediction of hepatocellular carcinoma development by plasma ADAMTS13 in chronic hepatitis B and C[J]. Cancer Epidemiol Bio-markers Prev，2011，20（10）：2204-2211.
[11] Bekhouche M，Leduc C，Dupont L，et al. Determination of the substrate repertoire of ADAMTS2，3，and 14 significantly broadens their functions and identifies extracellular matrix organization and TGF-beta signaling as primary targets[J]. FASEB J，2016，30（5）：1741-1756.
[12] 李漢军，董超，曹庭加，等. ADAMTS-2及TGF-β1在肝硬化安排中的表达[J]. 中南大学学报（医学版），2012， 10（37）：1026-1030.
[13] Hall NG，Klenotic P，Anand-Apte B，et al. ADAMTSL-3/punctin-2，a novel glycoprotein in extracellular matrix related to the ADAMTS family of metalloproteases[J]. Matrix Biol，2003，22（6）：501-510.
[14] Wang LW，Leonhard-Melief C，Haltiwanger RS，et al. Post-translational modification of thrombospondin type-1 repeats in ADAMTS-like 1/punctin-1 by C-mannosylation of tryptophan[J]. J Biol Chem，2009，284（44）：30004-30015.
[15] Campbell VT，Nadesan P，Ali SA，et al. Hedgehog pathway inhibition in chondrosarcoma using the smoothened inhibitor IPI-926 directly inhibits sarcoma cell growth[J]. Mol Cancer Ther，2014，13（5）：1259-1269.
[16] Seetharaman A，Selman G，Puckrin R，et al. MADD-4 is a secreted cue required for midline-oriented guidance in Caenorhabditis elegans[J]. Dev Cell，2011，21（4）：669-680.
[17] Llambi F，Causeret F，Bloch-Gallego E，et al. Netrin-1 acts as a survival factor via its receptors UNC5H and DCC[J]. EMBO J，2001，20（11）：2715-2722.
[18] Fearon ER，Cho KR，Nigro JM，et al. Identification of a chromosome 18q gene that is altered in colorectal cancers[J]. Science，1990，247（4938）：49-56.
[19] Drechsler M，Schmidt AC，Meyer H，et al. The conserved ADAMTS-like protein lonely heart mediates matrix formation and cardiac tissue integrity[J]. PLoS Genet，2013， 9（7）：e1003616.
[20] Chandra A，Jones M，Cottrill P，et al. Gene expression and protein distribution of ADAMTSL-4 in human iris，choroid and retina[J]. Br J Ophthalmol，2013，97（9）： 1208-1212.
[21] Le Goff C，Morice-Picard F，Dagoneau N，et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation[J]. Nat Genet，2008，40（9）：1119-1123.
[22] Dubuisson L，Lepreux S，Bioulac-Sage P，et al. Expression and cellular localization of fibrillin-1 in normal and pathological human liver[J]. J Hepatol，2001，34（4）：514-522.
[23] Lorena D，Darby IA，Reinhardt DP，et al. Fibrillin-1 expression in normal and fibrotic rat liver and in cultured hepatic fibroblastic cells：Modulation by mechanical stress and role in cell adhesion[J]. Lab Invest，2004，84（2）：203-212.
[24] Hubmccher D，Apte SS. ADAMTS proteins as modulators of microfibril formation and function[J]. Matrix Biol，2015， 47：34-43.
[25] Sengle G，Tsutsui K，Keene DR，et al. Microenvironmental regulation by fibrillin-1[J]. PLoS Genet，2012，8（1）：e1002425.
（收稿日期：2016-07-19）
