徐威 贝朝涌 粟谋 陈宁 蒋林彬
[摘要] 意图 调查全骨髓贴壁培育法培育骨髓基质干细胞的效果。 办法 将4周龄健康SD大鼠脱颈处身后，无菌条件下取出股骨和胫骨，搜集骨髓腔细胞悬液，L-DMEM培育基培育，经过全骨髓贴壁培育法将细胞纯化传代，调查其成长特性，制作成长曲线。流式细胞仪检测细胞外表符号物CD29、CD45、CD90并作同型对照，细胞分别向成骨、成脂方向诱导分解，调查诱导成果。 成果 经全骨髓贴壁培育法培育的SD大鼠BMSCs呈集落状贴壁成长，镜下可见细胞成簇成长，相似鱼群状、菊花瓣状或漩涡状。BMSCs增殖速度快，细胞形状安稳，成长状况较好。成长曲线显现BMSCs契合正常细胞成长特征且成长活泼。流式细胞仪判定CD29和CD90呈阳性表达，CD45呈阴性表达。BMSCs能向成骨、成脂方向诱导分解。 定论 全骨髓贴壁培育法简略易行，可取得纯度高，活性好，性状均一的骨髓基质干细胞。
[关键词] 骨髓基质干细胞；别离纯化；培育；分解；判定
[中图分类号] R414.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）32-0030-05
[Abstract] Objective To observe the effect of BMSCs through the method of whole bone marrow adherent culture. Methods After 4-weeks-old healthy SD rats were killed by cervical dislocation， the femur bone and tibia bone were taken out under sterile conditions. Marrow cell suspensions were collected then cultured in L-DMEM medium. The method of the whole bone marrow adherent culture was used to passage purified. The growth characteristic was observed and the growth curve was drawn. CD29， CD45， CD90 of the cell surface markers were detected by flow cytometry and made an isotype control. The cells could be induced to differentiate into osteogenic and adipogenic direction respectively and the results were observed. Results Cultured by the method of the bone marrow adherent， the BMSCs of SD rat showed colony adherent growth and other sharp like cell clusters， similar fish，daisy-like petals or whirlpool under microscope. BMSCs had high rate of proliferation， stabilization of morphology and good growth condition. BMSCs showed the growth characteristics of normal cells and actively growing in the growth curve. The expression of CD29 and CD90 were identified positive by flow cytometry. The expression of CD45 showed negative. BMSCs could be induced to differentiate into osteogenic and adipogenic direction， respectively. Conclusion The method of whole bone marrow adherent culture is simple and can get bone marrow stromal cells of high purity， activity， and homogeneous traits.
[Key words] Bone marrow stromal cells； Isolated and purified； Culture； Differentiation； Identification
1976年Friedenstein等[1-4]从骨髓中别离出骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs），并发现该细胞能在体外许多增殖，贴壁呈集落样成长，而且具有定向分解的才能。因其选材简洁，克服了部分伦理道德和免疫排挤等问题[5，6]，因而遭到人们的广泛重视。因为BMSCs无特异性的外表抗原表型，因而对BMSCs进行别离、提纯、判定存在必定的难度。现在，首要有全骨髓贴壁培育法、流式细胞仪分选法、密度梯度离心法和免疫磁珠分选法取得BMSCs。虽然现在有许多种办法能从骨髓中别离获取BMSCs，可是仍没有一个最佳的培育计划[7-9]。本研讨测验全骨髓贴壁培育法体外培育SD大鼠骨髓基质干细胞，调查其生物学特性，判定细胞表型，并定向诱导其分解成骨、成脂，以期取得一种成长状况杰出，纯度高，生物学性状安稳的大鼠骨髓基质干细胞。
1 资料与办法
1.1 资料
4龄SD大鼠10只（SPF级），男女不限。体重约120 g/只。购于广西医科大学动物试验中心。合格证号：SCXK（桂）2009-0002。DMEM-LG培育基，重生胎牛血清（美国Hyclone公司）。0.25% EDTA-胰酶（上海生工生物工程技术有限公司）。噻唑蓝（MTT）青-链霉素（双抗），二甲基亚砜（DMSO）（北京赛莱博科技发展有限公司）。Anti-Mouse/Rat CD29 （Integrin beta 1） FITC，Anti-Rat CD45 PE，Anti-rat CD90 FITC，Armenian Hamster IgG Isotype Control FITC，Mouse IgG1 K Isotype Control PE（ebioscience公司）。成骨诱导分解培育基，成脂诱导分解培育基，茜素红溶液，油红O溶液（cyagen公司）。
1.2 办法
1.2.1 研讨时刻 2012年9月～2013年4月。
1.2.2 试验细胞选材 处死大鼠后，放入75%酒精浸泡约10 min，无菌条件下取出股骨和胫骨，PBS冲刷后，剪开两边骨端，DMEM低糖培育液冲刷骨髓腔，搜集细胞悬液，并置入70 mm细胞培育皿内，参加适量彻底培育基，放置于 37℃、5% CO2恒温培育箱内培育。
1.2.3 大鼠BMSCs培育及传代 上述骨髓细胞悬液培育3 d后初次换液，今后每2天换液一次，以去除未贴壁细胞。当贴壁细胞达80%～90%交融时，去除培育液，胰蛋白酶消化。1000 rpm/min离心5 min，依照1∶2份额传代，每2天换液一次，直至细胞交融至80%～90%，再进行消化传代。
1.2.4 大鼠BMSCs细胞形状调查 倒置相差显微镜下调查细胞形状，镜检摄影。
1.2.5 大鼠BMSCs成长曲线制作（MTT法） 以1×104/cm2接种处于对数成长期的P7代BMSCs于96孔板。每孔参加200 μL彻底培育液置于37℃、5% CO2孵箱中培育，隔天换液1次。从种板第2天起每天取一板，每孔参加MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，37℃、5% CO2孵箱中培育4 h后停止培育。弃除孔中培育液。每孔参加150 μL DMSO溶液，置于摇床上缓慢摇匀10 min，使结晶物充沛溶解。酶标仪测定，挑选490 nm波长，测各孔吸光度值。以时刻为横坐标，吸光度均值为纵坐标制作细胞成长曲线。
1.2.6 大鼠BMSCs流式细胞仪细胞表型判定 胰蛋白酶消化P7代大鼠BMSCs，PBS液停止消化，短时低速离心2～3次，以去除细胞悬液中的细胞碎片。计数细胞：以106个/管的细胞数分别参加A、B、C、D、E共5个EP管。A管参加2 μL CD29-FITC，B管参加1.25 μL CD45-PE，C管参加1.25 μL CD90-PE，D管参加2 μL CD29同型-FITC，E管参加1.25 μL同型-PE。4℃冰箱避光孵育30 min。PBS液洗刷1～3次，以200 μL PBS液重悬细胞后，细胞筛过滤，移入上样管，流式细胞仪检测外表符号CD29、CD45、CD90表达状况。
1.2.7 成骨诱导 挑选P5代SD大鼠BMSCs，待细胞到达80%～90%交融时，消化。将干细胞接种于枯燥的明胶溶液六孔板中，每孔约3×103个细胞，参加2 mL/孔干细胞彻底培育液。放入37°C，5% CO2孵箱中培育24 h后，移除培育液，参加2 mL/孔成骨诱导液。每3天换液，诱导3周后进行茜素红染色。对照组参加等量彻底培育基，相同条件下培育进行茜素红染色。倒置相差显微镜下调查两组成果并摄影。
1.2.8 大鼠BMSCs成脂诱导 挑选P5代SD大鼠BMSCs，0.25%胰酶消化接种于六孔板中，每孔约2.0×104个，参加2 mL彻底培育液置于37°C，5%CO2孵箱中培育。每3天替换细胞彻底培育液，直至细胞成长到达100%交融。移除培育液，每孔参加2 mL成脂诱导液A，3 d后替换成成脂诱导液B进行坚持培育，24 h后替换成成脂诱导液A再次诱导，重复3～5个循环。当脂滴呈现较多，但形状较小时，改用成脂诱导液B进行坚持7 d，脂滴增大时，行油红O染色。对照组参加等量的彻底培育基，相同条件下培育进行油红O染色。倒置相差显微镜下调查两组成果并摄影。
2 成果
2.1 大鼠BMSCs成长及形状调查
经体外培育的大鼠P0代BMSCs 24 h后部分细胞开端贴壁，48～72 h贴壁细胞在皿底伸打开，呈短梭形；1～2 d后细胞形状呈多边形，细胞呈集落状成长。P0代细胞增殖速度较慢，约5～7 d后细胞集落集合达80%以上，并快速开端增值，细胞形状以梭形为主，较共同。倒置相差显微镜下调查可见细胞成簇成长，相似鱼群状、菊花瓣状或漩涡状。全骨髓贴壁培育法培育的SD大鼠BMSCs能安稳增殖10代以上。P1～P5代BMSCs增殖速度较快，细胞成长状况好，形状安稳。这以后逐渐减慢，P10代之后细胞形状显着老化，细胞包体变大，边际粗糙，形状不规则。见封三图9。
2.2 MTT法制作大鼠BMSCs成长曲线
SD大鼠BMSCs在接种于6孔板后1～ 2 d，细胞成长曲线低平，吸光值改变不大，为细胞埋伏习惯期。随后的第3～8天见细胞成长曲线呈“J”型，阐明该时刻段细胞处于对数成长期。第8天后细胞增殖减慢显着，曲线变得陡峭，进入渠道期。见图1。
2.3 大鼠BMSCs流式细胞仪进行细胞CD29、CD45、CD90表型判定成果
本试验取CD29、CD45、CD90及其同型抗体，流式细胞仪进行细胞表型判定，成果标明，全骨髓贴壁培育法培育的第7代SD大鼠BMSCs表达CD29，CD90，阳性率为90.4%，81.2%；而不表达CD45，阳性率为0.6%。同型-FITC表达率为0.4%，同型-PE表达率为0.4%，阐明本试验培育的细胞契合大鼠BMSCs的表型特征。见图2。
2.4 大鼠BMSCs成骨诱导成果
将成骨诱导液培育诱导21 d的SD大鼠BMSCs和一般彻底培育液培育诱导21 d的SD大鼠BMSCs一起行茜素红染色后，放置于倒置相差显微镜下调查。倒置相差显微镜下可见诱导培育组呈现显着染色的钙结节，而对照组未见钙结节。阐明本试验诱导培育的SD大鼠BMSCs具有成骨才能。见封三图10。
2.5 大鼠BMSCs成脂诱导成果
将成脂诱导液诱导培育5个周期的SD大鼠BMSCs和一般彻底培育液诱导培育的SD大鼠BMSCs一起进行油红O染色后，放置于倒置相差显微镜下调查成果。倒置相差显微镜下可见诱导培育组呈现染色显着的脂滴，而对照组未见显着的脂滴。阐明本试验诱导培育的SD大鼠BMSCs具有成脂才能。见封三图11。
3 评论
3.1 BMSCs的体外别离与培育
全骨髓贴壁培育法是使用最早的纯化、别离BMSCs的办法。由Luria 等[10]首要发现BMSCs贴壁成长的特性，并发明晰这种纯化、别离BMSCs的培育办法。全骨髓贴壁培育法依据BMSCs在培育皿中贴壁成长，而造血系细胞在培育皿中悬浮成长的特性差异，经过定时替换培育液，去除悬浮细胞和细胞碎片，搜集贴壁成长的BMSCs的办法。
该培育法所抽取的骨髓不经过过滤也不离心，骨髓中丰厚的成长因子得以保存，这些成长因子能促进BMSCs的增殖。其操作简略，既降低了离心对细胞的危害，又减少了污染时机，节约试验费用，且别离的BMSCs贴壁时刻短，增殖周期短，细胞数量较多，经屡次传代后能够逐渐纯化，是获取别离BMSCs的本钱低价的简略有用办法[11-13]。
本试验使用全骨髓贴壁培育法纯化和别离SD大鼠骨髓基质干细胞，经体外培育的大鼠P0代BMSCs 24～48 h左右部分细胞开端贴壁，48～72 h贴壁细胞在皿底伸打开，呈短梭形；1～2 d后细胞呈集落状成长，部分细胞呈多边形，细胞形状首要为成纤维样细胞。传代细胞12 h左右能安稳贴壁，并快速开端增值，细胞形状以梭形为主，较共同，倒置相差显微镜下调查可见细胞成簇成长，相似鱼群状、菊花瓣状或漩涡状。约2～5 d长满瓶底。全骨髓贴壁培育法培育的SD大鼠BMSCs能安稳增殖10代以上。细胞增殖速度快，细胞成长状况杰出，细胞形状均一安稳。SD大鼠BMSCs在接种于6孔板后1～2 d为细胞埋伏习惯期，随后的第3～8天见细胞成长曲线呈“J”型，阐明该时刻段细胞处于对数成长期。第8天后细胞增殖减慢显着，曲线变得陡峭，进入渠道期。从细胞增殖传代才能和形状学上调查该法可取得成长状况杰出，高纯度的SD大鼠BMSCs。
3.2 BMSCs的表型判定
迄今为止BMSCs外表抗原具有非专一性，BMSCs外表未发现特异性抗原表型。BMSCs表达CD105、CD73、CD90、CD29等。BMSCs不表达HLA-DR，即首要安排相容性复合物分子，不表达HLA-Ⅱ抗原、MHC-Ⅱ分子、B7-1、B7-2、CD11a、CD40和Fas L，不表达或极低水平表达HLA-Ⅰ抗原、MHC-Ⅰ分子。BMSCs也不表达造血细胞外表阳性标志，例如CD14、CD34、CD45等[14]，BMSCs具有低免疫原性、诱导免疫耐受和免疫抑制的效果。现在，对BMSCs的研讨仍处于探究阶段，还没有抱负的、用于判定的标志性分子或办法[15-17]。2006年，世界细胞医治协会断定BMSCs的判定规范为：①从骨髓中提取，在塑料培育皿内贴壁成长，在含血清的培育基内高度增殖。②表达CD105、CD73、CD90，不表达CD34、CD45、CD14或CD11b、CD79a或CD19；③在体外能够分解为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。并非某个或某几个外表符号契合干细胞的特性就能证明该细胞是BMSCs。一般是经过BMSCs的细胞形状、表型及功能来归纳判定。
本试验取CD29、CD45、CD90及其同型抗体，用流式细胞仪进行细胞表型判定，成果显现，该法培育的P7代SD大鼠BMSCs表达CD29，CD90，阳性率分别为90.4%，81.2%；而不表达CD45，阳性率为0.6%。同型-FITC表达率为0.4%，同型-PE表达率为0.4%，阐明本试验诱导培育的细胞契合大鼠BMSCs的表型特征。
3.3 BMSCs的多向分解潜能判定
BMSCs具有很强的多向分解以及自我更新潜能，且经屡次传代后，这些细胞还能坚持多向分解潜能。最近的研讨标明BMSCs可在体内、体外诱导分解成为各族中胚层安排来历的细胞[18-22]。
本试验将成骨诱导液培育诱导的SD大鼠BMSCs行茜素红染色后，放置于倒置相差显微镜下调查成果，倒置相差显微镜下可见染色显着的钙结节，而对照组未见钙结节。阐明本试验培育诱导的SD大鼠BMSCs具有成骨才能。将成脂诱导液培育诱导的SD大鼠BMSCs行油红O染色后，放置于倒置相差显微镜下调查成果。倒置相差显微镜下可见显着染色的脂滴，而对照组未见显着的脂滴。阐明本试验培育的SD大鼠BMSCs具有成脂才能。
综上所述，全骨髓贴壁培育法培育出的BMSCs为成长状况杰出，纯度高，且分解及增殖才能强的BMSCs。
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（收稿日期：2015-08-27）
