林素挺 陈平 崔大伟
[摘要] 意图 剖析急性呼吸道感染門诊患者的临床特征和病毒谱，为患者的临床医治供给根据。 办法 搜集2015年1月～2016年12月具有急性呼吸道感染症状的门诊患者的临床材料，并搜集患者的咽拭子样本。使用多重PCR办法检测15种呼吸道病毒，并使用实时荧光RT-PCR技能辨别甲型流感病毒的3种常见亚型。 成果 465例门诊患者中，呼吸道病毒阳性137例，检出率为29.5%（137/465），其间单一病毒感染94.2%（129/137），病毒共感染5.8%（8/137）；单一病毒感染中，以流感病毒为主，其次为肠道；病毒共检出中以鼻病毒和时节性H3N2流感病毒共检出为主。临床特征显现，病毒阳性患者的部分临床症状比病毒阴性患者重，更简单呈现高热、咽喉痛、乏力、鼻涕、痰液及呼吸短促等症状，且肺部反常多见。不同年纪段患者的感染率存在必定的差异，<5岁患儿最高（50.0%），其次为≥60岁的老年人（38.6%）。 定论 呼吸道病毒是导致门诊患者发作急性呼吸道感染的常见原因，特别是婴幼儿和老年人，因而，加强呼吸道病毒的检测将有助于急性呼吸道感染患者的防治。
[关键词] 急性呼吸道感染；呼吸道病毒；甲型流感病毒；聚合酶链式反响
[中图分类号] R512.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）18-0116-04
Clinical characteristics and etiologic spectrums of outpatients with acute respiratory infections
LIN Suting1 CHEN Ping2 CUI Dawei3
1.Department of Laboratory Medicine， the Peoples Hospital of Yueqing in Zhejiang Province， Yueqing 325600， China； 2.Department of Laboratory， the First Hospital Affiliated to Zhejiang University of TCM， Hangzhou 310006， China； 3.Department of Laboratory， the First Affiliated Hospital， College of Medicine， Zhejiang University， Hangzhou 310003， China
[Abstract] Objective To analyze clinical characteristics and etiologic spectrums of outpatients with acute respiratory infections（ARIs） for providing basis for clinical treatment of patients. Methods Clinical data and throat specimens of outpatients with ARIs were collected from Jan 2015 to Dec 2016. Their samples were detected for fifteen respiratory viruses by multiple polymerase chain reaction （PCR）， and three subtypes of influenza A virus （FluA） were identified by real-time RT-PCR assay. Results Of 465 outpatients， 137 cases were positive for respiratory viruses， and the total positive rate was 29.5% （137/465）. The percentage of single virus infection was 94.2% （129/137）， and mixed infection was 5.8% （8/137）. FluA virus was most pathogens of single virus infection， followed by enterovirus（EV）. The coinfection with RhV+sH3N2 was major for the mixed infection. Some of clinical symptoms from outpatients with positive viruses were more severe than that of cases with negative viruses， and the outpatients with positive viruses had easily high fever， sore throat， fatigue， nasal discharge， sputum， and shortness of breath and other symptoms， and abnormal lung. The positive rate was significantly different among different ages， the highest of positive rate was children less than five years old（50.0%）， followed by the elderly over the age of 60（38.6%）. Conclusion Respiratory virus is one common cause of outpatients with ARIs， especially young children and the elderly， therefore， the enhancement of respiratory virus detection will contribute to prevention and control of outpatients with ARIs.endprint
[Key words] Acute respiratory infections； Respiratory virus； Influenza A virus； Polymerase chain reaction
呼吸道病毒是引起人类发作急性呼吸道感染（acute respiratory infections， ARIs）的常见要素，并导致高的发病率和死亡率，特别是在发展中国家[1-2]。常见的人呼吸道病毒首要包含：甲型（FluA）和乙型（FluB）流感病毒、鼻病毒（RhV）、呼吸道合胞病毒（RSV-A/B）、肠道病毒（EV）、人腺病毒（ADV）、人副流感病毒（PIV1-4）、人偏肺病毒（hMPV）、人冠状病毒（CoV-229E/NL63，CoV-OC43/HKU1）和人博卡病毒（BoV）等[3-5]。人甲型流感病毒常见的首要包含3种：时节性H1N1病毒（sH1N1）、时节性H3N2病毒（sH3N2）和盛行性H1N1（2009）病毒[6]。引起ARIs的呼吸道病毒谱和患者的临床特征在不同区域存在必定的差异，因而，监测ARIs门诊患者的临床特征和呼吸道病毒谱有助于ARIs患者的防备和医治。本研讨对2015～2016年浙江省乐清市人民医院具有ARIs症状的门诊患者的临床特征和呼吸道病毒谱进行剖析。
1 目标与办法
1.1 研讨目标
搜集2015年1月～2016年12月在浙江省乐清市人民医院发热门诊就诊的465例急性呼吸道感染患者的临床材料，并搜集患者的临床样本（咽拭子），且患者就诊前均未使用过抗生素。浙江省乐清市人民医院是本区域最大的综合性医院。患者的临床样本于-70℃保存待检。465例患者中，男257例，女208例，年纪6个月～86岁，均匀28.5岁。
1.2 核酸提取
取咽拭子采样管中200 μL样本液，使用德国QIAGEN公司的病毒核酸提取试剂盒（Rneasy Mini Kit，货号：74104）提取病毒核酸，搜集终体积为50 μL的病毒核酸RNA洗脱液，并使用NanoDrop ND-2000 核酸剖析仪检测洗脱液的浓度和纯度，于-70℃保存备用。
1.3 多重PCR检测呼吸道病毒
首要使用大连Takara公司的Prime Script TM Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（货号：6210A）将病毒核酸RNA合成为cDNA，再使用韩国Seegene公司的多重PCR试剂盒（SeeplexR RV15 ACE Detection Kit，货号：RV6F00Y）进行扩增（试剂盒组成见表1）。PCR扩增在BIO-RAD S1000TM Thermal Cycler进行，反响体系为：3 μL的cDNA，4 μL的5×RV15 ACE引物（A，B，or C），3 μL的8-MOP缓冲稀释液，10 μL的2×混合反响液，整体积为20 μL。PCR扩增条件为：94°C 15 min灭活，40循环（94°C 30 s，60°C 90 s），72°C延伸90 s，扩增后的PCR产品经1.5%的琼脂糖凝胶电泳后再使用凝胶成像体系（BIO-RAD GelDocTM XR+ System）对其进行剖析。此外，针对甲型流感病毒阳性的样本，使用前期报导的单管多重荧光RT-PCR办法区别sH1N1、sH3N2和H1N1（2009）三种亚型[6]。
1.4 统计学办法
使用SPSS17.0软件对年纪、临床特征、性别等材料进行χ2查验，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 病毒检测状况
465例具有ARIs症状的门诊患者中，呼吸道病毒的阳性检出率为29.5%（137/465）。单一病毒感染所占的份额为94.2%（129/137），病毒共检出所占份额为5.8%（8/137）。在单一病毒感染中，FluA病毒所占份额最高，为55.0%（71/137），其间sH3N2病毒为38株，H1N1（2009）为33株，未检出sH1N1病毒；其次为EV，共检出12例，阳性率为9.3%；再次为RhV，检出率8.5%。病毒共感染中，以兩种病毒共检出为主，其间RhV+sH3N2为最多，所占份额为50.0%；仅发现1例感染三种病毒（RhV+sH3N2+CoV-OC43/HKU1）。
2.2 患者的临床特征
465例门诊患者中，病毒检出率在性别上无明显差异（χ2=0.579，P=0.447）；病毒阳性的门诊患者中：高热（≥38.0℃）的份额明显高于病毒阴性的患者，而低热（37.5℃<发热<38℃）的份额明显低于病毒阴性患者（χ2=18.822，P<0.001）；咽喉痛（χ2=36.187，P<0.001）、乏力（χ2=20.268，P<0.001）、头痛（χ2=62.7，P<0.001）、呼吸短促（χ2=88.46，P<0.001）、肺部听诊反常（χ2=32.565，P<0.001）及肺部X线/CT体现反常（χ2=20.841，P<0.001）等症状的份额均明显高于病毒阴性患者，差异有统计学含义（表2）。
2.3 不同年纪段的病毒散布
不同年纪段的病毒总检出率存在明显差异（χ2=31.276，P<0.001），其间<5岁患儿的病毒检出率最高（50.0%），其次为≥6岁的老年人（38.6%）。单一病毒感染患者中，不同年纪段的病毒检出率也存在类似的明显差异（χ2=24.479，P<0.001）。此外，<5岁患儿的病毒共检出检出率也最高（4.3%，4/92），且肠道病毒检出率也最高（8.7%，8/92）（表3）。
3 评论
呼吸道病毒导致的人类发作ARIs，国内外的研讨目标首要重视住院人群，特别是儿童，而门诊患者的相关研讨相对较少[2-5]。国内关于浙江省乐清区域关于急性呼吸道感染门诊患者的临床特征和病毒谱的研讨未见报导。本研讨首要重视于具有ARIs症状的门诊患者的病毒感染状况，成果显现：至少一种呼吸道病毒的阳性检出率为29.5%，与美国匹兹堡（69%）、我国甘肃省（37.6%）、山东省（35.75%）、美国（58%）和上海区域（32.09%）等国内外的相关报导存在必定的差异[2-5，7]。这可能与患者的年纪、样本搜集的时刻及时节、样本的来源地等要素的不同存在必定的联系。病毒阳性的患者大都为单一病毒感染，以FluA病毒为主，而病毒共检出相对较少，以RhV+sH3N2为最多，这与前期我国山东省、上海区域、深圳和巴西、维多利亚等国家和区域的相关报导根本共同[4，5，7-9]。这些研讨标明急性呼吸道感染中以单一病毒感染为主，而流感病毒是其首要病原，病毒共检出相对较少。咱们估测这可能与机体的抵抗力、感染的时节和病毒在体内的竞赛成长等要素有关。endprint
ARIs引起患者的臨床症状首要为发热（>37.5°C）伴咳嗽、咽喉痛、呼吸短促和（或）流鼻涕等[2，4]。本研讨显现大都门诊患者以高热（≥38.0℃）为主（81.3%），且病毒阳性的门诊患者发作高热的份额明显高于病毒阴性的患者，这与甘肃省、山东省和黎巴嫩贝鲁特区域等前期的相关报导存在必定的差异[4，10]。此外，咽喉痛、乏力、呼吸短促、肺部听诊反常和肺部X线/CT体现反常等参数与美国匹兹堡和我国山东省等国内外的报导根本共同[2，4，10]。这些临床症状的异同与研讨目标的年纪、感染的时节、病原的品种和患者的卫生环境等要素可能存在必定的联系[1， 4，10]。
前期研讨标明，儿童和老年人引起免疫力相对较差，是病毒感染的高危人群[11-15]，而青少年因大都时刻在校园学习，简单在病毒的盛行时节被感染[1，7，16]。本研讨显现，儿童的病毒感染率明显高于其他年纪群，其次是老年人，且肠道病毒和病毒共感染在儿童中的份额也相对较高。标明年纪是影响病毒感染和病毒品种的一个重要要素，这与我国上海、深圳和巴西、维多利亚等国家和区域的前期报导根本共同[7，8，13-15]。
急性呼吸道感染是人类最常见的流行症之一，较高的发病率和死亡率给人类的健康带来严峻的要挟，而呼吸道病毒是最常见的要素之一[1-3]。现在，病毒培育虽然是病毒检测的“金规范”，但由于费时吃力，生物安全要求高，且灵敏性不高级要素影响，约束了其在临床上的推行[6，17]。聚合酶链反响（PCR）技能及其衍生的荧光PCR和多重PCR技能，在病毒确诊上因其快速、灵敏、特异等要素的影响，已广泛使用于临床和试验室研讨[17-19]。本研讨所选用的试剂盒为世界认可的多重PCR试剂盒，灵敏性和特异性均较高，且可一起检测15种病毒得到广泛的使用[9，20-21]，这使咱们检测的成果实在牢靠。呼吸道病毒是引起ARIs的重要要素，应加强呼吸道病毒的检测，特别是对儿童和老年人，为ARIs临床患者的及时确诊和医治供给根据。本研讨初次体系性剖析了浙江省乐清区域急性呼吸道感染门诊患者的临床特征和病毒谱，为患者的临床医治供给科学的根据。
本研讨只是挑选乐清区域最大的综合性医院，本区域的其他医院因各种原因没有选入研讨单位，且因其样本量相对较少和临床及试验室数据的部分不完善等要素，对成果剖析存在必定的影响，将在未来的试验中加大样本量的搜集和挑选本区域多家医院进行研讨，并逐步完善这些缺乏。
[参考文献]
[1] Niederman MS，Krilov LR. Acute lower respiratory infection in developing countries[J]. Lancet，2013，381（9875）：1341-1342.
[2] Zimmerman RK，Rinaldo CR，Nowalk MP，et al. Viral infections in outpatients with medically attended acute respiratory illness during the 2012-2013 influenza season[J].BMC Infect Dis，2015，15：87.
[3] Huang G，Yu D，Mao N，et al. Viral etiology of acute respiratory infection in Gansu Province，China，2011[J]. PLoS One，2013，8：e64254.
[4] Liu T，Li Z，Zhang S，et al. Viral Etiology of acute respiratory tract infections in hospitalized children and adults in Shandong Province，China[J]. Virol J，2015， 12：168.
[5] Fowlkes A，Giorgi A，Erdman D，et al. Viruses associated with acute respiratory infections and influenza-like illness among outpatients from the Influenza Incidence Surveillance Project，2010-2011[J]. J Infect Dis，2014，209（11）：1715-1725.
[6] Qin M，Wang D，Huang F，et al. Simultaneous detection of novel H1N1 virus， seasonal H1N1 and H3N2 virus in reaction tube by multiplex real-time RT-PCR assay[J]. Chinese Journal of Virology，2011，26（2）：97-102.
[7] He J，Gong Y，Zhang W，et al. Study on the viral etiology of acute respiratory tract infections in Shanghai area during 2009-2010[J]. Journal of Microbes and Infections，2011，6（2）：90-96.
[8] Huang F，Liu F. Analysis of pathogen spectrum in patients with acute respiratory tract infection in Longgang district of Shenzhen city in 2013[J]. China Tropical Med-icine，2014，14（6）：698-700.endprint
[9] Martins Júnior RB，Carney S，Goldemberg D，et al. Detection of respiratory viruses by real-time polymerase chain reaction in outpatients with acute respiratory infection[J]. Mem Inst Oswaldo Cruz，2014，109（6）：716-721.
[10] Finianos M，Issa R，Curran MD，et al. Etiology，seasonality，and clinical characterization of viral respiratory infections among hospitalized children in Beirut，Lebanon[J]. J Med Virol，2016，88（11）：1874-1881.
[11] Chughtai AA，Wang Q，Dung TC，et al. The presence of fever in adults with influenza and other viral respiratory infections[J]. Epidemiol Infect，2017，145（1）：148-155.
[12] Newton AH，Cardani A，Braciale TJ. The host immune response in respiratory virus infection：Balancing virus clearance and immunopathology[J]. Semin Immunopathol，2016，38（4）：471-482.
[13] Malhotra B，Swamy MA，Janardhan Reddy PV，et al. Viruses causing severe acute respiratory infections（SARI）in children ≤5 years of age at a tertiary care hospital in Rajasthan，India[J]. Indian J Med Res，2016，144（6）：877-885.
[14] Tan JW，Nuryasmin R，Apandi Y，et al. Epidemiological and clinical features of enteroviral acute lower respiratory tract infections in hospitalized paediatric patients in a Malaysian tertiary center[J]. Med J Malaysia，2016，71（5）：264-268.
[15] Dong W，Chen Q，Hu Y，et al. Epidemiological and clinical characteristics of respiratory viral infections in children in Shanghai，China[J]. Arch Virol，2016，161（7）：1907-1913.
[16] Timmermans A，Melendrez MC，Se Y，et al. Human Sentinel Surveillance of Influenza and Other Respiratory Viral Pathogens in Border Areas of Western Cambodia[J]. PLoS One，2016，11（3）：e0152529.
[17] Wishaupt JO，van der Ploeg T，de Groot R，et al. Single- and multiple viral respiratory infections in children：Disease and management cannot be related to a specific pathogen[J]. BMC Infect Dis，2017，17（1）：62.
[18] Dai Y，Cui D，Yang X，et al. Detection of influenza A virus by multiplex real-time RT-PCR assay[J]. Chinese Journal of Clinical Laboratory Science，2015，33（9）：641-644.
[19] Cui D，Zhao D，Xie G，et al. Simultaneous detection of influenza A subtypes of H3N2 virus，pandemic（H1N1）2009 virus and reassortant avian H7N9 virus in humans by multiplex one-step real-time RT-PCR assay[J]. Springerplus，2016，5（1）：2054.
[20] Cho CH，Lee CK，Nam MH，et al. Evaluation of the AdvanSure real-time RT-PCR compared with culture and Seeplex RV15 for simultaneous detection of respiratory viruses[J]. Diagn Microbiol Infect Dis，2014，79：14-18.
[21] Chen JH，Lam HY，Yip CC，et al. Clinical Evaluation of the New High-Throughput Luminex NxTAG Respiratory Pathogen Panel Assay for Multiplex Respiratory Pathogen Detection[J]. J Clin Microbiol，2016，54（7）：1820-1825.
（收稿日期：2017-03-28）endprint
