李翀 唐纯娜 贺更生
[摘要] 意图 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）选择性诱导肿瘤细胞凋亡，可是其诱导促生计反响导致耐药。金雀异黄素按捺核因子-κB（NF-κB）活性。本文旨在评论金雀异黄素和TRAIL以及两者合用诱导人肝细胞癌SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞凋亡的效果。 办法 干细胞条件培育基超低粘附板培育SMMC-7721细胞取得第3代肿瘤球构成细胞，作为肝癌干细胞样细胞。金雀异黄素（10 μM）、TRAIL（10 ng/mL）及两者联合处理肝癌干细胞样细胞72 h；免疫酶联吸附试验（ELISA）测定细胞组蛋白/DNA碎片；碘化丙啶（PI）染色流式细胞术剖析细胞凋亡率；Western blot检测细胞NF-κB（p65）蛋白表达水平。 成果 10 μM 金雀异黄素诱导肝癌干细胞样细胞组蛋白/DNA碎片水平（100% vs 152%）和凋亡率[（2.71±0.64）% vs （5.14±0.76）%]适度增高（P<0.05）；10 ng/mL TRAIL对肝癌干细胞样细胞组蛋白/DNA碎片水平（100% vs 110%）和凋亡率[（2.71±0.64）% vs （3.15±0.72）%]无明显影响；10 μM 金雀异黄素预孵育1 h，联合10 ng/mL TRAIL处理导致组蛋白/DNA碎片水平（100% vs 568%）和凋亡率[（2.71±0.64）% vs （17.3±1.27）%]明显增高（P<0.05）。10 ng/mL TRAIL诱导肝癌干细胞样细胞NF-κB（p65）蛋白表达，10 μM 金雀异黄素按捺NF-κB（p65）蛋白表达，联合金雀异黄素与TRAIL有用下降NF-κB（p65）蛋白表达水平。 定论 金雀异黄素与TRAIL协同诱导肝癌干细胞样细胞凋亡触及NF-κB按捺。
[关键词] 肝细胞癌；肿瘤干细胞；细胞凋亡；NF-κB
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）13-0023-03
[Abstract] Objective Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand （TRAIL） has been demonstrated that selectively induced cancer cells， but facilitated prosurvival response leading to resistance. It has been reported that genistein could inhibit nuclear factor-κB（NF-κB） exprotein and activaty. The purpose of this study was to examine the effects of genistein or TRAIL， or both on apoptosis of liver cancer stem-like cells（LCSLCs） derived from SMMC-7721 cell line. Methods The third passage sphere-forming cells（SFCs） derived from SMMC-7721 cell line which was also called LCSLCs were obtained though suspended culture in ultra-low adhesion plate with stem cell-conditioned medium. LCSLCs were treated with Genistein（10 μM） and TRAIL（10 ng/mL） alone or in combination for 72 h. Histone/DNA fragment was tested using enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. And apoptosis rate was detected by flow cytometry （FCM） with propidium iodide（PI） staining； the protein expression of NF-κB（p65） was analyzed by western blot. Results The level of histone/DNA fragment（100% vs 152.6%） and apoptosis rate[（2.71±0.64）% vs （5.14±0.76）%] was increased moderately by genistein（10 μM） in LCSLCs（P<0.05）， but TRAIL（10 ng/mL） has no effect on histone/DNA fragment level（100% vs 110%） and apoptosis rate[（2.71±0.64）% vs （3.15±0.72）%]. After preincubation with 10μM genistein for 1h， the combination with 10 ng/mL TRAIL lead to significantly increase of histone/DNA fragment level（100% vs 568%） and apoptosis rate[（2.71±0.64）% vs （17.3±1.27）%] （P<0.05）. 10 ng/mL TRAIL induced NF-κB（p65） expression in LCSLCs. 10 μM genistein could suppress the protein expression of NF-κB（p65）. And the protein expression of NF-κB（p65） was significantly attenuated by the combination of genistein and TRAIL. Conclusion The apoptosis of LCSLCs which is co-induced by genistein and TRAIL is associated with the inhibition of NF-κB.
[Key words] Liver cancer； Cancer stem cell； Apoptosis； NF-κB
肝细胞癌位列癌症相关死因第三位；其死亡率高首要是因为高复发率和耐药性[1]。肿瘤干细胞理论以为肿瘤安排中存在化疗反抗的干细胞样细胞群，在肝细胞癌中，肝癌干细胞能在化疗后从头构建肿瘤[2]。肿瘤坏死因子相关凋亡配体（tumor necrosis factor-related apoptosis ligand，TRAIL）现已到达只针对恶性转化细胞和不影响正常细胞和不损害正常安排的医治成果。尽管Ⅰ/Ⅱ期临床试验现已证明重组可溶性TRAIL有杰出耐受性，可是其抗肿瘤活性有限[3]；此外，TRAIL信号并不总是导致癌细胞凋亡。事实上一些研讨标明，TRAIL能够经过某些信号分子包含核因子-κB（NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Akt等因子诱导促生计反响[3]。有研讨显现胶质母细胞瘤干细胞具有TRAIL抗性[4]。
金雀异黄素是大豆制品中的首要异黄酮。已有研讨证明金雀异黄素在体表里具有防备和医治包含肝细胞癌在内的多种肿瘤效果[5]。还有研讨标明，金雀异黄素经过按捺NF-κB活性增强肿瘤细胞的化疗敏感性[6]。可是金雀异黄素是否能经过按捺NF-κB活性增强TRAIL诱导肝细胞癌干细胞样细胞凋亡依然缺少文献资料。本文研讨金雀异黄素和TRAIL以及两者合用对人肝细胞癌SMMC-7721细胞系肝癌干细胞样细胞凋亡的效果，并评论其效果机制是否触及金雀异黄素按捺根底和TRAIL诱导NF-κB活性。
1 资料与办法
1.1细胞培育与试剂
人肝细胞癌细胞系SMMC-7721自上海我国科学院细胞库（我国上海）购得。SMMC-7721细胞系成长用增加10%胎牛血清、100 IU/mL盘尼西林、100 μg/mL链霉素的高糖DMEM培育基置5% CO2、37℃的培育箱培育。
金雀异黄素和胰岛素购自美国Sigma公司。重组人TRAIL购自美国R&D Systems 公司。高糖DMEM培育基、DMEM/F12培育基、50×B27增加物（不含维生素A）和胎牛血清购于美国Gibco公司。重组人表皮成长因子（EGF）和人碱性成纤维成长因子（bFGF）购于PROSPEC公司。鼠抗人NF-κB（p65）单克隆抗体购于美国Cell signaling公司；鼠抗人β-catenin单克隆抗体和辣根过氧化物酶结合的羊抗鼠二抗均购自美国Santa Cruz生物科技有限公司。
1.2肿瘤球培育
参照文献[7]描绘的办法，用无血清干细胞培育基[含20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、1×B27和0.4 μg/mL胰岛素的DMEM/F12（Gibco Invitrogen）培育基]悬浮，以5000细胞/孔的密度接种6孔超低粘附培育板。培育6 d，得到肿瘤球构成细胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，并计数。
1.3细胞凋亡检测
依照文献[8]描绘的办法，用碘化丙啶荧光染色流式细胞术测定细胞凋亡率以及酶联免疫吸附法测定细胞组蛋白/DNA碎片水平评价细胞凋亡程度。
1.4蛋白印迹剖析
依照文献[8]描绘的办法进行总细胞溶解产品的制备和蛋白印迹剖析。抗DR5抗体、抗NF-κB（p65）抗体和抗β-actin抗体作为一抗。用增强型ECL蛋白质印记剖析体系检测信号。
2成果
2.1肝癌干细胞样细胞的培育和扩增
干细胞条件培育基超低粘附板培育人肝细胞癌SMMC-7721细胞系细胞构成悬浮成长的肿瘤球（图1）。肿瘤球传代培育成果证明：第3代球构成细胞的肿瘤球构成率最高（18.92±2.17）%，作为后续试验研讨的肝癌干细胞样细胞模型。
2.2金雀异黄素和TRAIL及两者合用对肝癌干细胞样细胞组蛋白/DNA碎片水平的影响
ELISA测定成果显现：金雀异黄素（10 μM）处理导致肝癌干细胞样细胞组蛋白/DNA碎片水平增高52%（P<0.05）；TRAIL（10 ng/mL）处理仅进步10%，差异无统计学含义；金雀异黄素（10 μM）与TRAIL（10 ng/mL）合用使组蛋白/DNA碎片水平增高468%，提示联合金雀异黄素（10 μM）与TRAIL（10 ng/mL）协同性诱导肝癌干细胞样细胞凋亡。见图2。
2.3金雀异黄素和TRAIL及两者合用对肝癌干细胞样细胞凋亡率的影响
PI染色流式细胞术剖析成果证明：溶媒（0.1% DMSO）处理、金雀异黄素（10 μM）处理、TRAIL（10 ng/mL）处理以及联合金雀异黄素（10 μM）和TRAIL（10 ng/mL）处理肝癌干细胞样细胞凋亡率分别是（2.71±0.64）%、（5.14±0.76）%、（3.15±0.72）%和（17.3±1.27）%（图3），阐明联合金雀异黄素与TRAIL协同性诱导肝癌干细胞样细胞凋亡。
2.4 联合金雀异黄素与TRAIL下调NF-κB（p65）蛋白表达
Western blot剖析成果标明，10 ng/mL TRAIL诱导肝癌干细胞样细胞NF-κB（p65）蛋白表达，10 μM 金雀异黄素按捺NF-κB（p65）蛋白表达，联合金雀异黄素与TRAIL有用下降NF-κB（p65）蛋白表达水平（图4）。
3评论
尽管TRAIL具有选择性肿瘤细胞毒性，不影响非恶性转化细胞，可作为一种很有出路的抗癌药物[9]；可是，咱们的试验成果发现，TRAIL（10 ng/mL）处理SMMC-7721细胞系球构成细胞即界说的肝癌干细胞样细胞不能有用诱导细胞凋亡；其依据包含不能有用增高细胞组蛋白/DNA碎片水平缓细胞凋亡率。这些成果供给了肝癌干细胞样细胞具有TRAIL诱导细胞凋亡耐受性的依据。咱们还证明TRAIL （10 ng/mL）处理诱导NF-κB（p65）蛋白表达，然后提示，肝癌干细胞样细胞发生TRAIL诱导细胞凋亡耐受性的可能机制之一是其诱导NF-κB所造成的。
尽管金雀异黄素（10 μM）只能细微诱导肝癌干细胞样细胞凋亡，可是，当运用金雀异黄素（10 μM）预孵育后联合TRAIL（10 ng/mL）处理导致肝癌干细胞样细胞组蛋白/DNA碎片水平缓细胞凋亡率增高数倍。这些成果证明，联合金雀异黄素和TRAIL能够引起协同性诱导肝癌干细胞样细胞凋亡效果，因而，有可能铲除肝癌干细胞样细胞，进而发挥医治人肝细胞癌效果。咱们的成果显现，金雀异黄素不仅能下调根底NF-κB（p65）蛋白表达，并且能有用按捺TRAIL诱导的NF-κB（p65）蛋白表达。这些成果启迪咱们，金雀异黄素可能经过按捺TRAIL诱导NF-κB（p65）蛋白表达即NF-κB活化增强TRAIL诱导肝癌干细胞样细胞凋亡效果。因而，咱们的研讨成果为临床使用天然制剂金雀异黄素和选择性肿瘤细胞凋亡诱导剂TRAIL靶向肿瘤干细胞医治肿瘤特别是肝细胞癌供给了合理性的解说。
[参考文献]
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（收稿日期：2015-03-05）
