姚远+仝立国+冯玛莉+范惠霞
[摘要] 意图 研讨不同办法提取的黃芪-莪术提取物的抗肿瘤效果。 办法 树立人肝癌细胞株HepG2模型，别离以95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉、传统水煎四种办法为提取工艺，用CCK-8法检测不同提取物对HepG2细胞按捺成长效果，并用流式细胞法检测其体外诱导HepG2细胞凋亡的状况。用小鼠肝癌H22细胞树立移植性肝癌模型，检测上述提取物体内抗肿瘤活性，用免疫安排化学法检测H22肝癌安排中NF-κB p65的表达状况。 成果 CCK-8成果显现，与阴性组比较，黄芪-莪术95%乙醇和50%乙醇提取物组最高按捺率别离为89.13%、78.36%，差异有计算学含义（P<0.05），醇沉和水煎提取物组最高抑瘤率别离为20.38%、18.78%，差异无计算学含义（P>0.05）。流式细胞术成果显现，95%乙醇提取组和50%乙醇提取物组能显着诱导HepG2细胞凋亡，水提醇沉组和传统水煎组效果不显着。95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉、传统水煎四种提取物对小鼠H22荷瘤均有必定的抑瘤效果，抑瘤率别离为47.55%、36.12%、29.96%、34.68%。与模型组比较，95%乙醇和50%乙醇提取物组能显着下降H22荷瘤安排中NF-κB p65水平的表达 （P<0.05）。 定论 黄芪-莪术95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉、传统水煎四种提取物均有按捺小鼠H22荷瘤成长效果，可是只要95%乙醇和50%乙醇提取物能按捺NF-κB p65蛋白的表达，并有按捺人肝癌HepG2细胞成长及诱导其发作细胞凋亡的效果。
[关键词] 黄芪；莪术；HepG2细胞；细胞凋亡；NF-κB p65
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）07-0033-04
[Abstract] Objective To study the anti-tumor effect of the extract of Astragalus and Curcuma zedoaria Rosc by different methods. Methods Liver cancer cell line HepG2 model was established by four kinds of methods including 95% ethanol， 50% ethanol， water extraction and ethanol precipitation and the traditional decoction for the extraction process.The inhibitory effect of different extracts on the growth of HepG2 cells was detected by CCK-8 method.And the apoptosis of HepG2 cells was detected by flow cytometry.The model of transplanted hepatocellular carcinoma（HCC） was established by mouse liver cancer H22 cells.The antitumor activity in the above-mentioned extract was examined. The expression of NF-κB p65 in H22 hepatocellular carcinoma tissues was detected by immunohistochemistry. Results The CCK-8 results showed that the highest inhibitory rates were 89.13% and 78.36% in Astragalus-Curcuma 95% ethanol and 50% ethanol extraction groups respectively compared with that in the negative group， and the difference was significant （P<0.05） .The highest inhibitory rates were 20.38% and 18.78% respectively in ethanol precipitation and decoction extraction groups， and the difference was not significant（P>0.05）.The results of flow cytometry showed that 95% ethanol extraction group and 50% ethanol extraction group could obviously induce HepG2 cell apoptosis， while the roles of the water extraction and alcohol precipitation group and the traditional decoction group were not obvious.Four extracts including 95% ethanol， 50% ethanol， water extraction and ethanol precipitation and traditional decoction all had inhibitory effect on H22 tumor in mice. The tumor inhibition rates were 47.55%， 36.12%， 29.96% and 34.68% .Compared with the model group， 95% ethanol and 50% ethanol extraction groups could significantly decrease the expression level of NF-κB p65 in H22 tumor tissue（P<0.05）. Conclusion Astragalus and Curcuma zedoaria Rosc 95% ethanol， 50% ethanol， water extraction ethanol precipitation and traditional decoction could inhibit the growth of H22 tumor in mice.But only 95% ethanol and 50% ethanol extracts could inhibit the expression of NF-κB p65 protein， and have the effect of inhibiting the growth of human liver cancer HepG2 cells and inducing the apoptosis of HepG2 cells.
[Key words] Astragalus； Curcuma zedoaria Rosc； HepG2 cells； Apoptosis； NF-κB p65
肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球是第五个最常见的癌症，因为乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染的传达其发病率正在世界范围内不断添加，特别是肝硬化患者最易发作[1]。我国是肝细胞肝癌高发区，且死亡率均高于世界其他国家的均匀水平，每年全球新发的肝癌病例中，我国就占到一半以上[2]。现在肝癌的医治手法仍以化疗和前期手术切除为主，但能手术切除者仅占10%～15%[3]。因而肝癌的内科医治关于中晚期患者来说显得非常重要。中药可效果于肿瘤发作和开展的多环节、多靶点，避免复发搬运，副效果轻，价格低廉等长处而倍受重视。所以近年来中医药医治肿瘤的研讨的得到广泛重视，在抗肿瘤方面取得了可喜的成果。细胞凋亡遍及存在于生物界。在肿瘤的发作进程中，NF-κB的过度表达，会削减细胞凋亡发作，按捺其在肿瘤细胞中的过表达，在肿瘤的医治中含义严重[4]。本文首要论述黄芪-莪术不同提取物按捺人HepG2细胞成长及诱导其凋亡的效果和对小鼠H22荷瘤安排中NF-κB p65蛋白调理效果。
1 材料与办法
1.1 试验药物
氟尿嘧啶打针液（上海旭东海普药业有限公司，批号：FA150205）；打针用环磷酰胺 （CTX，山西普德药业股份有限公司，批号：04141102）；黄芪 （产自甘肃，出产批号：150502），莪术（产自广西，批号：150403），均购买于毫州成源中药饮片有限公司。
1.2 试剂
CCK-8 （日本同仁，批号：FJ692）；细胞凋亡检测试剂盒（凯基生物，批号：20150528）；NF-κB p65（北京博奥森生物，批号：AE063028）。
1.3 动物与瘤株
昆明种小鼠[（购自北京海淀兴隆试验动物养殖场，男女参半，许可证号：SCXK（京）2014-0013）]；HepG2 细胞由山西医科大学细胞生物教研室惠赠；H22细胞由山西省肿瘤医院惠赠。
1.4 仪器
BioTeK酶标仪（美国BioTeK）；Cytomics流式细胞仪（美国BECKMAN，FC 500型）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂，RE-6000A型）；离心沉积机（上海医用剖析仪器厂，LXJ-Ⅱ型）；电热恒温鼓风枯燥箱（上海跃进医疗器械厂，101-2-S型）。
1.5 办法
1.5.1 药物提取 称取黄芪-莪术（1∶1）各200 g，粉碎成粗粉。（1）选用95%乙醇对黄芪-莪术中的挥发油以及极性较小的脂溶性成分进行提取。将粗粉加6倍量95% 乙醇，回流提取3次，每次1 h，兼并提取液，浓缩枯燥，即得95% 乙醇提取物。（2）选用50%乙醇对黄芪-莪术中的三萜类、皂苷类以及黄酮类等中等极性成分进行提取。办法同（1）。（3）选用水提醇沉法对黄芪-莪术中的粗总多糖进行提取。将两药材加8倍量水，提取3次，兼并提取液，浓缩至必定体积后加三倍体积80%乙醇沉，放置过夜，离心，搜集沉积物，枯燥，即得水提醇沉提取物。（4）选用水煎煮法对黄芪-莪术混合进行提取。将两药材加8倍量水，提取3次，每次1.0 h，兼并提取液，浓缩枯燥，即得水煎提取物。
1.5.2 黄芪-莪术不同提取物对HepG2细胞增殖和凋亡的影响 （1）细胞增殖按捺率：搜集对数期细胞，离心，去上清，参加37℃預热培养基混匀，用细胞计数板在显微镜下细胞计数，细胞接种浓度为：1.5×105个/mL，接种于96孔板，每孔100 μL，放入37℃，5% CO2培养箱中孵育24 h，各组给药终浓度别离为：95%乙醇提取物组（800、400、200、100、50 μg/mL）；50%乙醇提取物、水提醇沉物组和传统水煎物组（2000、1000、500、250、125 μg/mL），阳性对照组为顺铂 2 μg/mL，每组设3个复孔。在加药后24 h，经过CCK-8法检测每个组的OD450值，别离核算细胞按捺率，每组成果用三个复孔均匀值标明。试验重复3次。细胞增殖按捺率=（阴性组OD450-试验组OD450）/（阴性组OD450-空白组OD450）×100%。（2）细胞凋亡率：依据CCK-8的成果选取黄芪-莪术95%乙醇提取物组 （400 μg/mL）；50%乙醇提取物、水提醇沉物组和传统水煎物组（2000 μg/mL）进行细胞凋亡检测。取对数期细胞，调整细胞浓度为2×105/mL，接种于6孔板，给药24 h后，1000转/min离心5 min，搜集细胞，用1×PBS洗两遍，依据试剂及流式细胞仪器阐明检测各组HepG2细胞凋亡状况。
1.5.3 黄芪-莪术不同提取物对小鼠H22荷瘤成长按捺效果 在无菌条件下，将H22小鼠乳白色腹水，按1∶10参加生理盐水，冲打混匀。医用酒精消毒小鼠右上腋窝部位，皮下接种0.2 mL细胞悬液。分为模型组、阳性组、95% 醇提组、50%醇提组、水提醇沉组、传统水煎组共6组，每组10只，男女参半。接种24 h后给药，灌胃给药，模型组每天灌等剂量的生理盐水，阳性组给予环磷酰胺（30 mg/kg），隔天腹腔打针。接连灌胃11 d后，称重，在无菌条件下剥离瘤块并称重。肿瘤按捺率=（模型组均匀瘤重-试验组均匀瘤重）/模型组均匀瘤重×100%。
1.5.4 免疫组化法检测H22小鼠荷瘤安排中NF-κB p65分子表达状况 将H22荷瘤安排放入4% 的多聚甲醛固定，惯例脱水后用白腊包埋，厚度4 μL接连切片，依照试剂盒的阐明完结免疫安排化学染色。用Image Pro-Plus 6.0软件400倍拍照相片，挑选阳性方针染色区域，丈量其累积分光密度（IOD Sum）和面堆集加值（area Sum），成果用均匀积分光密度（mean density）=（IOD Sum）/（area Sum）标明。
1.6 计算学办法
选用SPSS19.0计算学软件进行剖析，计量材料以均数±标准差（x±s）标明，两两比较选用LSD-t查验，P<0.05代表具有计算学差异。
2 成果
2.1 黄芪-莪术四种不同的提取物对HepG2细胞增殖的按捺效果
用CCK-8法检测黄芪-莪术四种不同提取物对HepG2细胞增殖的影响，95%乙醇、50%乙醇、醇沉和水煎提取物最高按捺率别离为89.13%、78.36%、20.38%、18.78%，见表1。
2.2 黄芪-莪术不同提取物对HepG2细胞凋亡的影响
经黄芪-莪术不同提取物处理24 h后的HepG2肝癌细胞，用流式细胞仪检测，95%醇提物、50%醇提物、醇沉物和水煎物组前期凋亡率别离为49.6%、46.2%、10.1%、12.3%。与阴性对照组比，95%醇提物和50%醇提物组能显着诱导HepG2细胞凋亡，见封三图3。
2.3 黄芪-莪术不同提取物体内对H22实体瘤的按捺效果
计算成果显现，黄芪-莪术四个提取物组的均匀瘤重低于模型组，与模型组比较均有显著性差异，95%醇提取物组、50%乙醇提取物组、醇沉提取物组、水煎提取物组抑瘤率别离为47.55%、36.12%、29.96%、34.68%，成果见表2。
2.4 各组H22荷瘤安排中NF-κB p65蛋白表达状况
免疫安排化学成果显现，与模型组比较，95%醇提取物组和50%醇提取物组中NF-κB p65蛋白表达水平下降，差异有显著性（P<0.01），醇沉物和水煎物组有下降趋势，可是与模型组比较较差异无计算学含义。见表3、封三图4。
3 评论
黄芪为补气类代表药物，具有补气固表，利尿脱毒、排脓、敛疮生肌等成效。现代研讨标明其首要成分为多糖类、黄酮类、皂苷类以及微量元素和氨基酸等成分[5]。莪术为行气活血类代表药物，具有行气破血，消积止痛的成效，用于癥瘕痞块，瘀血闭经，食积肿痛等症。现代研讨标明其首要成分是莪术油[6]。二者的有效成分对某些肿瘤细胞有直接的按捺效果，且在机体全体水平有抑瘤效果，如医治胃癌、肝癌、妇科肿瘤等方面已发挥初步成效[7-9]。本试验用不同种属来历肝癌细胞人HepG2肝癌细胞和小鼠H22肝癌细胞为研讨目标，发现黄芪-莪术95%乙醇提取物、50%乙醇提取物、水提醇沉物和水煎提取物尽管对小鼠肝癌H22荷瘤都有必定按捺效果，可是只要95%乙醇提取物和50%乙醇提取物對人肝癌HepG2细胞有显着按捺效果。
细胞凋亡（apoptosis）是机体细胞一种自发的、有条理的生理代谢进程。细胞凋亡与生物的发育、机体免疫功用安稳以及肿瘤的发作有着亲近的联络。肿瘤的发作最首要的原因就是一系列能够诱导细胞凋亡发动的因子（ced基因宗族、Caspase基因宗族、P53基因等）遭到按捺，使细胞凋亡程序不能正常发动然后不能铲除癌基因及其产品。所以细胞凋亡激活细胞发作细胞凋亡的程序，特异的杀伤肿瘤细胞，是肿瘤医治的重要手法。在本试验中发现，四个黄芪-莪术提取中，只要95%乙醇提取物和50%乙醇提取物能够显着诱导人HepG2肝癌细胞凋亡，所以黄芪-莪术95%乙醇提取物和50%乙醇提取物诱导HepG2细胞凋亡是二者抗肿瘤效果机制之一。
NF-κB（nuclear factor-κB）是一种细胞核转录因子，与肿瘤细胞的发作、凋亡、侵袭和搬运等亲近相关而备受重视。在哺乳动物细胞中常以NF-κB p65与NF-κB p50 结合构成二聚体。NF-κB的激活受广泛的信号调理，其间大多数信号与细胞应激有关[10，11]。静息状态下，NF-κB首要与其按捺因子（I-κBα）结合构成复合体定坐落细胞质中。当被淋巴因子、细胞因子、药物等激活后，I-κBα被水解释放出NF-κB，最终搬运到细胞核[12]。大多数肿瘤细胞中NF-κB信号通路都处于继续激活状态。激活的NF-κB能够按捺TNF-α、促进VEGF等的表达，然后促进肿瘤细胞成长搬运[13]。研讨标明[14，15]，黄芪、莪术有按捺胃癌和乳腺癌细胞中NF-κB的表达效果。本文研讨发现，与模型组比较，NF-κB p65蛋白的表达量只在95%乙醇提取物和50%乙醇提取物组显着下降 （P<0.01）。提示黄芪-莪术95%乙醇提取物和50%乙醇提取物抗肿瘤效果与有下降NF-κB p65蛋白下降有关。
综上所述，黄芪-莪术95%乙醇、50%乙醇、水提醇沉和水煎四种提取物均有按捺小鼠H22荷瘤成长的效果，其间只要95%乙醇和50%乙醇提取物有按捺H22荷瘤安排中NF-κB p65蛋白表达和按捺人肝癌HepG2细胞成长及诱导其发作凋亡的效果。
[参考文献]
[1] Llovet J M，Burroughs A，Bruix J. Hepatocellular carcinoma[J].New England Journal of Medicine，2004，362（9399）：1907-1917.
[2] 段纪俊，陈万青，张思想.我国恶性肿瘤死亡率的世界比较[J].我国社会医学杂志，2009，26（6）：377-378.
[3] 杨建宇，郑黎，李彦知，等.中西医结合医治中晚期肝癌的现状及展望中医肿瘤临床研讨进展一瞥[J].我国中西医肿瘤杂志，2011，1（1）：171-175.
[4] Hernandez L，Kim MK，Noonan AM，et al. A dual role for Caspase8 and NF-κB interactions in regulating apoptosis and necroptosis of ovarian cancer，with correlation to patient survival[J].Nature，2015，1：15053.
[5] 陈婷婷.黄芪药材及其相关制剂的指纹图谱研讨[D]. 第二军医大学，2008.
[6] 曾建红，莫炫永，戴平，等.广西莪术挥发油抗肿瘤效果的谱效联系研[J].我国试验方剂学杂志，2012，18（13）：91-94.
[7] 王道军，王晨伍权，丁守勇，等.黄芪打针液对胃癌大鼠血清炎症机制、p53、STAT3、VEGF表达的影响[J].我国老年学，2016，36（18）：4405-4407.
[8] 王金全，陈启助，黄树林，等.黄芪总提取物促进PBMC对肝癌细胞的体外杀伤效果[J].广东药学院学报，2016，32（1）：66-70.
[9] 赵凡，尹刚，唐德才，等.黄芪莪术配伍对人卵巢癌HO-8910原位移植瘤安排中FGF-2和BCL-2表达的影响[J].时珍国医国药，2015（7）：1537-1540.
[10] Grilli M，Chiu JJ，Lenardo MJ. IMF-κB and Rel：Participants in a Multiform Transcriptional Regulatory System[J]. International Review of Cytology-a Survey of Cell Biology，1993， 143（143）：1-62.
[11] Verma IM. Rel/NF-κB/IκB family：Intimate tales of association and dissociation[J].Genes & Development，1995，9（22）：2723-2735.
[12] Zandi E，Rothwarf DM，Delhase M，et al. The IkB kinase complex（IKK） contains two kinase subunits，IKKa and IKKb，necessary for IkB phosphorylation and NF-κB activation[J].Cell，1997，243-252.
[13] Antwerp DJV，Martin SJ，Verma IM，et al. Inhibition of TNF-induced apoptosis by NF-κB[J].Trends in Cell Biology，1998，8（3）：107-111.
[14] 寧玲，齐红艺.莪术醇调控Akt/JNK/NF-κB介导的MMP-9信号通路按捺乳腺癌细胞搬迁与侵袭才能研讨[J]. 全国临床中药学学术年会，2015：128-130.
[15] 骆殊，沈洪，朱学军，等.黄芪、莪术配伍对胃癌MKN-45细胞COX-1、COX-2、NF-κB、VEGF、MMP-2表达的影响[J].现代中西医结合杂志，2009，18（4）：351-353.
（收稿日期：2016-12-09）
