周会霞+章正祥+陈强+孔敏露+邓玉+程静+侯群+邵敏峰
[摘要] 意图 本研讨旨在11周龄硝酸甘油偏头痛模型大鼠头痛行为学的根底上结合临床偏头痛的头痛症状学对偏头痛大鼠模型的外表效度进行研讨。 办法 根据体重及根底痛阈将36只大鼠随机分红四组，即正常组、模型组、西药组（苯甲酸利扎曲普坦）、中药组（川芎-天麻），每组9只。造模后，用高清摄像头记载大鼠行为学2 h。经过空白对照和药物反证医治进行体系点评。 成果 造模后2 h内，模型组爬笼及理毛次数少于正常组，犯难次数多于正常组。西药组及中药组犯难次数少于模型组。 定论 犯难次数能够作为点评偏头痛大鼠模型外表效度的中心内容及判别药物作用的目标。一起发现，11周龄偏头痛大鼠行为可能与人类偏头痛症状更附近。
[关键词] 偏头痛；硝酸甘油；外表效度；周龄
[中图分类号] R747.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）25-0033-04
Study on the surface validity of 11-week-old nitroglycerin rat model
ZHOU Huixia1，2 ZHANG Zhengxiang3 CHEN Qiang3 KONG Minlu4 DENG Yu1 CHENG Jing1 HOU Qun3 SHAO Minfeng1
1.No.1 School of Clinical Medicine， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China； 2.Department of Neurology， the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， No.1 School of Clinical Medicine， Zhejiang Chinese Medical University， Zhejiang Provincial Hospital of TCM， Hangzhou 310006， China； 3.Zhejiang Xiaoshan Hospital， Hangzhou 311202， China； 4.Hangzhou Geriatric Disease Hospital， Hangzhou 310022， China
[Abstract] Objective To study the surface validity of migraine rats on the basis of the headache behavioral science of 11-week-old nitroglycerin migraine rate model combined with the symptomatology of clinical migraine. Methods 36 rats were randomly divided into 4 groups according to body weight and basic pain threshold， namely normal group， model group， Western medicine group（Rizatriptan）， and traditional Chinese medicine group（ligusticum wallichii-gastrodia elata）， with 9 rats in each group. After modeling， the behavior of rats was recorded by high-definition camera for 2 hours. A systematic review was conducted by blank control and drug counterevidence therapy. Results Within 2 hours after modeling， the frequency of climbing cage and grooming in the model group was less than that in the normal group， and the frequency of scratching head was more than that in the normal group. The frequency of scratching head in the Western medicine group and Chinese medicine group was less than that in the model group. Conclusion Scratching head can be used as the core content of evaluating surface validity of migraine rats and the index of judging drug efficacy. At the same time， the behavior of 11-week-old migraine rats are found to be more likely to be associated with human migraine symptoms.
[Key words] Migraine； Nitroglycerin； Surface validity； Week age
偏頭痛是一种常见的缓慢神经血管性疾病，我国患病率为9.3%[1]，好发于中青年，40岁[2]达最高峰，40岁后发病率开端下降。2013年全球疾病担负查询的研讨成果标明偏头痛为人类第三位常见疾病，按失能所造成的生命年丢失（years of life lost to disability，YLDs）核算，偏头痛为第六位致残性疾病[3]。硝酸甘油模型具有操作简略、机制单一、短时刻内可很多仿制等长处，且其行为学体现及病理生理改变与人类发病时的体现及改变类似，因而被广泛应用于偏头痛相关课题的研讨。本研讨选用11周龄[4，5]大鼠经过视频录像办法对硝酸甘油大鼠模型行为学进行体系点评。endprint
1 材料与办法
1.1 试验动物
SD雄性大鼠36只，体重（300.81±10.84）g（浙江省试验动物中心，许可证号SCXK（浙）20140001），浙江中医药大学动物试验中心供给。分笼养殖于浙江中医药大学动物试验中心。试验时刻：2015年2～5月。
1.2 药品及试剂
苯甲酸利扎曲普坦（批号140404），湖北欧立制药有限公司出产；川芎（1403158），天麻（1404046）江阴天江药业有限公司出产；硝酸甘油打针液（批号20131223），北京益民药业有限公司出产；0.9%NaCl溶液（F1412033），杭州民生药业有限公司出产。西药组及中药组均用超纯水定容稀释。
1.3首要仪器设备
Nanopure UV/UF归纳剖析型超纯水体系（D11931），美国BARNSTEAD公司出产；电子天平（CP213），奥豪斯仪器（上海）有限公司出产；松下高清摄像机（HC-V210M），松下电器（我国）有限公司出产；数显鼠光热测痛仪（JD-A）：上海继德教育试验器械厂出产。
1.4 造模
36只健康SD雄性大鼠经过7 d的适应性养殖，先予两次甩尾试验，取均值，即根底痛阈。动物按体重及根底痛阈随机分红四组：正常组、模型组、西药组、中药组，每组9只，组间均衡。正常组及模型组均予超纯水灌胃（给药体积：1 mL/100 g）；西药组予苯甲酸利扎曲普坦溶液灌胃（给药剂量：0.816 mg/kg，给药体积：1 mL/100 g）；中药组予川芎-天麻溶液灌胃（给药剂量：2449 mg/kg，给药体积：1 mL/100 g）。各组动物共灌胃7 d，每天1次。
以上四组中除正常组外，其他各组在完结第7天灌胃后0.5 h，进行硝酸甘油造模，即腹腔打针硝酸甘油（给药剂量：10 mg/kg，给药体积：0.2 mL/100 g），正常组予腹腔打针0.9%生理盐水（给药体积：0.2 mL/100 g）进行对照。第7天造模前测得一切SD大鼠体重为（360.36±13.35）g（适当于11周龄[4，5]）。
1.5 行为学查询
打针完结后当即进行大鼠行为学查询，并用高清摄像机进行记载，合计2 h，计算造模后2 h内各行为呈现的次数。首要查询以下3个行为学症状。①爬笼：双前爪离地搭于桶壁上或腾空站立为爬笼。②理毛：大鼠用嘴舔舐爪子及身上的毛，或用前后爪搔抓头面部以外区域的毛。③犯难：大鼠运用前爪或后爪敏捷搔抓头面部，接连挠计为一次，若中心有中止或许夹有其他动作，则计为两次。
1.6 计算学办法
选用SPSS 20.0计算学软件进行剖析，计数材料选用频数标明。选用Shapiro-Wilk查验法进行正态性查验，正态计量材料以均数±规范差（x±s）标明，非正态计量材料以中位数（四分位距离）标明。方差齐性者比较选用单要素方差剖析，其间两两比较选用SNK法；方差不齐者比较选用非参数查验的Kruskal-Wallis法，其间两两比较选用一切成对比较（all pairwise multiple comparisons）法。各组材料均以α=0.05为显著性水平。
2 成果
2.1各组大鼠体重改变
干涉前，各组大鼠根底体重无计算学差异。第1天，正常组大鼠体重较模型组低，差异有计算学含义（P=0.007，P<0.01），西药组大鼠体重较模型组高，差异有计算学含义（P=0.027，P<0.05），第2天到第6天模型组与其他各组大鼠体重相较无计算学差异（P>0.05）。提示中、西药对体重无显着影响。见表1。
2.2 行为学成果
造模后2 h内，正常组大鼠一直活动自若，模型组、西药组、中药组大鼠在造模后5 min左右开端呈现活动削减及厌倦体现。其间模型组的爬笼及理毛次数[0（2.5），1（3.5）]显着少于正常组[43（24），13（5.5）]，差异有计算学含义（P爬笼=0.000，P理毛=0.000，P<0.01），而模型组犯难次数[1（3）]则多于正常组[0（0）]，差异均有计算学含义（P=0.002，P<0.01），标明造模成功。西药组及中药组犯难次数[0（0.5），0（0.5）]少于模型组[1（3）]，差异均有计算学含义（P西药组=0.042，P中药组=0.031，P<0.05），标明西药与中药均有必定医治作用，见表2。
3 评论
偏头痛模型广泛应用于偏头痛发病机制及临床新药的研讨，查询目标多种多样。现在最常用的是热及机械痛阈值测定，用von Frey纤维丝测定足底或许面部、眶周苦楚敏理性，热板试验、甩尾试验、Hargreaves测定法[6]等测定热敏理性。但由于痛觉超敏推迟发生[6]，Tassorelli C等[7]研讨发现硝酸甘油在给药后2～4 h诱导痛觉过敏，所以丈量时效性及准确性难以掌握。并且虽然有近2/3偏头痛患者有异常性苦楚[8]，但异常性苦楚不是偏头痛的确诊规范。Jones MG[9]等经过肌电图定量测定响应于角膜空气气泡引起的眼轮匝肌眨眼反射的强度，直接记载硝酸甘油引起的三叉神经通路的激活。别的還有大鼠面部苦楚表情量表（RGS）测定面部动作[10]、光暗盒或许高架十字迷宫等测定畏光行为。但这些特征体现只存在于偏头痛部分亚型。
偏头痛的首要确诊根据是苦楚，而苦楚是一种生物感觉，是发生在清醒状态下的、有行为反响的感觉，所以研讨偏头痛模型与苦楚相关的外表效度更具说服力。外表效度是指动物模型中动物与人类之间现象学的类似性，即症状同源性。关于偏头痛模型来讲，外表效度就是指能够多大程度上反映人类偏头痛的客观行为目标。现在判别偏头痛模型的行为学规范仍未共同，因而树立较好的外表效度至关重要，但一起又存在必定的困难，原因有：单个目标与临床体现不符；判别的个人片面性较强；目标过于单一等。endprint
硝酸甘油作为NO的前体，经过激活血管平滑肌细胞内鸟苷酸环化酶扩张血管诱发头痛的发生，参加苦楚的激起与保持[11]。硝酸甘油模型具有操作简略、机制单一、经济、短时刻内可很多仿制等长处，且其清醒时的行为学体现与患者临床癥状共同性较高，可较直观反映苦楚的发生，故本研讨选用了该造模法。
硝酸甘油偏头痛大鼠的行为学现在首要有耳红、爬笼、理毛、犯难等，现在大都研讨[12-15]发现大鼠在造模后即呈现烦躁不安，体现为耳红、爬笼、犯难次数增多、过度理毛等，他们以为这些行为学体现与临床患者烦躁不安、易激惹体现类似，可解释为由焦虑心情引起的自主活动增多。但李涛等[16]发现腹部皮下打针硝酸甘油的大鼠一开端体现自若，3～5 min后呈现精神不振、反响迟钝。姜维等[17]、王克柱[18]研讨发现偏头痛造模后起先半小时，模型组较对照组犯难显着增多，爬笼无差异，随后以活动削减、厌倦为主。这与本试验共同。Tassorelli C[19]也以为偏头痛大鼠在发病期间体现为活动削减，不进食饮水。这些体现则与临床患者懒散、疲倦无力、昏昏欲睡等症状相符。以上两种研讨成果不共同，所以咱们以为点评该模型的行为学目标仍未共同，有待进一步讨论。
Andrews N等[20]研讨发现损害周围神经，体现为先天挖洞行为的显着削减。别的有发现苦楚能够引起试验动物进食削减[21]。已知中脑导水管周围灰质（PAG）调理苦楚的关键部位，Depaulis A等[22]经过药物影响PAG发现，作为对“深层次”或“不可避免的”苦楚，缓慢损害或失利的反响，动物通常会削减运动，变得愈加孤单，对环境的反响削弱。与本研讨模型组爬笼、理毛显着削减相共同。也与人类偏头痛患者体现的厌倦乏力相共同，且与偏头痛确诊规范“活动后加剧”相照应。偏头痛的特征是严峻的苦楚和对感觉影响的敏理性添加，导致正常日常活动的按捺。据流行病学查询显现，有大于50%[23]的患者需求卧床歇息来医治偏头痛发生。由此可知，按捺性行为是偏头痛的重要特征之一，一起也是动物对苦楚的遍及反响，并非偏头痛所特有。
本研讨发现硝酸甘油偏头痛大鼠模型除理毛、爬笼等日常活动受按捺外，有特征性的犯难行为的添加，且中药组或西药组干涉后均显着削减。这与Melo-Carrillo A和Lopez-Avila A[24]的发现部分相共同，他们经过影响大鼠硬脑膜，发现偏头痛大鼠歇息、冻住行为、同侧后爪犯难较对照组显着增多。但不论行为活泼或按捺，上述研讨偏头痛模型均有显着添加的行为特征，即犯难。该行为是对片面苦楚感直接且客观的反响，与临床患者的头痛症状相符，故咱们有理由以为犯难可作为判别模型成功的中心目标。
偏头痛好发于中青年，40岁[2]达最高峰，40岁后发病率开端下降。从分子生物学视点阐释，Fan PC等[25]研讨发现青春期大鼠和成年期大鼠有适当的三叉神经根颈部复合体（TCC），但三叉神经血管体系（TGVS）的外周反响性比成人差，有年纪依赖性差异。故试验大鼠年纪的选取与偏头痛结局显着相关。本试验第7天造模前测得一切SD大鼠体重为（360.36±13.35）g（适当于大鼠11周龄[4，5]），现在大部分偏头痛动物模型的研讨选取的大鼠体重在200～300 g（适当于7～8周龄大鼠[4，5]）。因而部分研讨体现为举动活泼，可能与青少年大鼠发病率低，三叉血管体系外周反响差，尚构不成典型的偏头痛模型有关。不过现在这些仅仅猜想，尚需求试验进一步证明。为了能尽量客观地点评模型大鼠的行为学，本研讨选用高清摄像机进行全程录制，以便后期能够重复进行点评，添加行为学点评的准确性。别的，在目标的挑选上，咱们考虑到行为学目标的易查询性、可量化性等要素，最终将爬笼、理毛、犯难作为查询目标。成果显现，模型组犯难次数显着多于正常组，与既往的研讨成果均相契合，一起又是对苦楚的直接反映，因而，咱们以为犯难可作为点评偏头痛模型行为学的中心目标之一。
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