朱机灵 叶迅
[摘要] 意图 经过调查雷公藤内酯醇（TP）对高糖影响下ILK、MMP9、NEPH1蛋白表达的影响，评论TP按捺足细胞上皮-间充质转分化（EMT）医治糖尿病肾病的可能机制。 办法 将培育分化老练的足细胞分为对照组（D-葡萄糖5 mmol/L）、高糖组（D-葡萄糖25 mmol/L）、低TP组（25 mmol/L D-葡萄糖+8 ng/mL TP）、中TP组（25 mmol/L D-葡萄糖+16 ng/mL TP）以及高TP组（25 mmol/L D-葡萄糖+ 32 ng/mL TP）。体外培育48 h后，倒置显微镜调查细胞形状，并选用PCR半定量剖析技能检测ILK、MMP9、NEPH1的表达。 成果 高糖影响下足细胞NEPH1的表达较对照组显着削减（P<0.01），而ILK、MMP9的mRNA表达较对照组显着升高（P<0.01）。各剂量TP组足细胞NEPH1 mRNA的表达均较高糖组显着上调（P<0.01），ILK、MMP9 mRNA的表达较高糖组显着下降（P<0.01），其间以中TP组的干涉效果最显着（P<0.01）。 定论 TP可能经过按捺ILK信号通路来按捺足细胞EMT。
[要害词] 雷公藤内酯醇；足细胞；高糖；上皮-间充质转分化
[中图分类号] R197 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）31-0001-04
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是一类以进行性肾脏纤维化为特征的疾病，是糖尿病最首要的微血管并发症之一。其最首要的临床表现为蛋白尿，而肾小球纤维化是发作蛋白尿的组织学根底。足细胞经过已分化上皮细胞向间充质细胞转分化（Mesenchymal transdifferentiation，EMT），是影响肾小球滤过屏障功用和结构，使肾小球纤维化的重要因素[1]。其特色为失掉上皮细胞特征如足细胞裂孔膜蛋白（nephrin）和NEPH1～3等，导致成纤维细胞特别蛋白l（fibroblast-specific protein 1，FSP-1）、整合素衔接激酶（ILK）、细胞外基质纤维衔接蛋白（fibronectin，FN）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）等间充质细胞样表型标志物表达上调[2]。已发现的介导足细胞EMT的首要信号通路有TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-acatenin三条。三条通路既有各自的信号传导途径，又在不同层面彼此衔接、整合，组成扑朔迷离的网络，一起调控足细胞的EMT进程。其间，ILK信号通路在足细胞EMT的进程中起重要的调理效果[3]。
雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.F.，TwHF）是藤本植物雷公藤的枯燥块根，中药学以为其味苦、辛，性寒，有大毒，归肝、肾经。功用祛风除湿 、通络止痛，兼杀虫解毒。临床首要用于医治类风湿性关节炎、体系性红斑狼疮、肾脏疾病等炎性和本身免疫性疾病。其用于医治肾病已有30余年前史 ，从开始的生药煎剂到雷公藤提取物，取得了令人瞩意图效果[4]。雷公藤内酯醇（triptolide，TP）是从其间别离所得的一种二萜类化合物，可经过靶向转录因子、激酶或按捺泛素/蛋白酶体等机制发挥按捺细胞增殖和促肿瘤细胞凋亡等抗肿瘤效果[5]。很多体表里研讨均证明，雷公藤内酯醇具有维护足细胞、按捺蛋白尿的效果[6，7]。本研讨调查TP经过对ILK信号通路的调理效果，干涉高糖诱导小鼠足细胞EMT，评论TP对高糖环境下受损足细胞的可能维护机制。
1 材料与办法
1.1 一般材料
1.1.1 细胞 本研讨选用的小鼠肾小球足细胞为英国伦敦大学国王学院Guy's 医院赠送。
1.1.2 药物 葡萄糖（我国大冢制药有限公司），雷公藤内酯醇（杭州达文生物技能有限公司）。
1.2 仪器与试剂
超净工作台，空气过滤器（北京市昌平长城空气净化设备公司），恒温 CO2培育箱（B5060EK/CO2德国产），450 型主动酶标仪（MuLtiskan Ascent V1. 24345-00627T），伯樂PCR 仪，凝胶成像体系（ BIO-RAD），RPMI 1640培育液、胎牛血清（美国GIBCO公司），γ-干扰素（美国PEPROTECH公司），Trizol提取试剂盒（美国Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），引物组成（PRIMER5.0引物软件设计，上海生物工程公司组成），SDS-PAGE凝胶试剂盒（北京普利莱基因技能有限公司）。
1.3 办法
1.3.1 细胞培育 复苏后的小鼠足细胞参加含有5 mL 10% FCS1640培育液的50 mL培育瓶中，每瓶参加500 U γ-干扰素。置33℃、5%CO2培育箱孵育，细胞增殖传代后，转移入37℃、5%CO2培育箱（含有5 mL 10%FCS1640培育液，不加干扰素）分化老练（细胞形状表现为“树枝状”）。
1.3.2 试验分组 将分化老练的足细胞接种至50 mL 细胞培育瓶，选用RandA 1.0软件彻底随机分组法分为5 组，每组5 瓶细胞，对照组（Control Group：D-葡萄糖5 mmol/L）、高糖组（HG：D-葡萄糖25 mmol/L）、低TP组（LTP：25 mmol/L D-葡萄糖+8 ng/mL TP）、中TP组（MTP：25 mmol/L D-葡萄糖+16 ng/mL TP）和高TP组（HTP：25 mmol/L D-葡萄糖+32 ng/mL TP）。37℃、5%CO2培育箱孵育48 h后倒置显微镜下调查足细胞形状改动，并检测各组足细胞ILK、MMP9 和NEPH1的表达。
1.3.3 RT -PCR 半定量法检测ILK、MMP9、NEPH1 RNA 表达 Trizol 试剂和氯仿抽提足细胞总 RNA ，微量核酸测量仪测定每个RNA样品浓度（单位为μg/mL）；反转录酶M-MuLV 催化下组成 cDNA；在DNA 主动扩增仪上进行 PCR 反响。25 μL反响体系中含10×buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，引物正反义链各10 pmol，TaqDNA 聚合酶（购自上海博亚）1.5 U，cDNA 1 μL，加去离子水至终体积25 μL，石蜡油关闭。阴性对照以双蒸水代替cDNA。聚合酶链反响（PCR）引物均依据已知的小鼠ILK、MMP9、NEPH1和GAPDH 的基因序列由 PRIMER 5.0 引物软件设计，由上海生物工程公司组成。见表 1。
1.3.4 扩增反响条件 在94℃ 2 min进行预变性后：（1）NEPH1：94℃30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，进行35个循环。（2）ILK：95℃ 3 min，进入34个循环，94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s，進行34个循环。（3）MMP9： 94℃30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s，进行33个循环。（4）GAPDH：94℃ 30 s、59.8℃ 30 s、72℃ 30 s，进行25个循环。完结循环后，在72℃ 2 min进行终延伸。各PCR产品与DNA Marker（购自上海生物工程公司）在1.7%琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL溴化乙锭），0.5%TBE液中电泳（100 V，30 min），用BIO-RAD凝胶成像体系成像，凝胶定量软件Quantity-one剖析其光密度值，以GAPDH为内参照基因，比较各意图基因条带与内参照基因条带的光密度比值。
1.4 统计学剖析
选用SPSS 17.0统计学软件，计量材料以均数±标准差（x±s）进行统计学描绘，对高糖组与对照组行t查验，高糖组与其他各组行单因素方差剖析（ANOVA），方差齐时，两两比较选用LSD查验，方差不齐时用Tamhane查验，α=0.05。
2 成果
2.1 小鼠足细胞的形状学改动
倒置显微镜（扩大倍数400倍）调查足细胞形状，发现对照组足细胞呈“分支状”，分步均匀，细胞与细胞之间以“树枝状”足突相连，成长旺盛；高糖影响48 h后，足细胞足突缺少，部分集合；低TP组可见足细胞形状尚可，足突较对照组缺少，贴壁一般，成长尚可；中TP组足细胞足突较对照组少，但较高糖组多，细胞成长旺盛；高TP组足细胞形状尚可，足突粗短，部分细胞集合。由封三图1可见，对照组足细胞形状呈分化老练的“树枝状”，成长旺盛，而高糖组足细胞足突缺少，且有部分细胞逝世。与高糖组比较，细胞形状上，TP各组细胞足突均增多，尤以中TP组显着；细胞成长方面，低TP组和中TP组细胞成长旺盛，高TP组细胞部分集合，与高糖组相似。
2.2 对高糖影响下足细胞ILK、MMP9、NEPH1 mRNA表达的影响
与对照组比较，高糖组ILK mRNA及MMP9 mRNA表达显着升高（P<0.01），NEPH1 mRNA的表达显着下降（P<0.01）。与高糖组比较，不同剂量的TP均能显着下降ILK mRNA及MMP9 mRNA的表达（P<0.01），其间以中TP组的下降最显着（P<0.01）。与高糖组比较，不同剂量的TP均能显着上调NEPH1 mRNA的表达（P<0.01），其间以中TP组的升高最显着（P<0.01）。见表2、3，封三图 2、3。
3 评论
糖尿病肾病（DN）是糖尿病的首要并发症之一，其特征性的临床表现即蛋白尿，而蛋白尿的构成与肾小球滤过屏障功用和结构亲近相关。足细胞EMT是影响肾小球滤过屏障功用的要害病理学改动，是引发前期蛋白尿的首要原因[8]。研讨标明，经过按捺足细胞的EMT，可使足细胞能康复至正常的上皮细胞表型[9]。
已发现的介导足细胞EMT的首要信号通路有TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-acatenin三条。ILK信号通路中，ILK是一种存在于细胞胞质中的丝/苏氨酸蛋白激酶，是参加细胞表里信号传导通路构成的重要介质，调理细胞黏附、生计、分化和凋亡，在保持足细胞生物学特性上有重要意义[3]。ILK可与nephrin彼此效果，然后建立起衔接细胞-基质integrin信号通路与细胞-细胞信号通路的分子桥梁，可直接磷酸化下流几个重要的激酶，包含Akt和GSK-313，导致β-catenin的安稳[10，11]。有研讨发现激活的ILK能直接磷酸化糖原组成酶激酶-3（glyeogen synthase kinase-3，GSK-3），后者的磷酸化可激活活化蛋白-1（activatorprotein-1，AP-1），使MMP9的表达添加[12]。现在以为[13]ILK信号通路的失调，是引起慢性肾炎以及肾脏纤维化的重要原因。经过按捺ILK来到达推迟或反转EMT成为研讨热门。Huber MA等[14]经过研讨体内给予ILK小分子按捺剂可削减白蛋白尿，能削减足细胞上间质细胞标志物α-SMA和MMP9的表达，康复足细胞特异性标志物nephrin的表达，维护足细胞免受危害，然后维护肾小球滤过屏障功用。
肾小球足细胞发作EMT后间充质细胞的外表标志物之一的MMP9，是以Ⅳ型胶原为首要降解底物的明胶酶。足细胞发作EMT时，MMP9的表达显着增高，构成基底膜Ⅳ型胶原组成和分化失平衡，进而引发肾小球滤过膜、肾小球系膜病理学改动。
肾小球足细胞相关蛋白1（NEPH1）是一种在足细胞裂孔隔阂上表达的跨膜蛋白，具有组成滤过屏障和信号转导等功用。它与nephrin有亲近的彼此效果，极可能与nephrin有同源性或相似性[15]。与nephrin相似，NEPH1能以彼此交织的方式构成拉链样结构，起到分子屏障效果，是保持裂孔隔阂的完整性及滤过屏障的重要蛋白[16]。研讨标明，NEPH1可以有用维护足细胞，避免危害。调理NEPH1的表达，已成为维护足细胞的医治新法[17]。
雷公藤制剂医治糖尿病肾病已在临床上广泛应用，而其效果机制需要评论。已有研讨证明，雷公藤甲素可上调高糖诱导的足细胞nephrine 和podocin mRNA及其蛋白表达[18]。此外，TP还经过调理Smad信号途径减轻肾脏纤维化程度[19]。也有研讨发现，TP可以有用遏止p-38 MAPK信号通路的活化，显着下降p-38 MAPK的磷酸化水平，然后维护足细胞[20-24]。但是，现在尚缺少对TP调理ILK信号通路体外干涉足细胞EMT的研讨。本试验经过研讨其对高糖诱导下足细胞的ILK、MMP9、NEPH1的表达调理的影响，进一步了解雷公藤医治糖尿病肾病的机制。
本研讨发现，在25 mmol/L高糖诱导下足细胞发作了EMT，表现为NEPH1表达显着下降，而足细胞的ILK、MMP9的表达显着升高，提示足细胞的EMT进程中，ILK通路被过度激活，使MMP9表达升高，损坏基底膜Ⅳ型胶原组成和分化平衡，影响了足細胞的结构安稳。运用不同剂量TP干涉高糖诱导下的足细胞与高糖组比较，ILK、MMP9的表达均有不同程度的下调，NEPH1的表达则呈不同程度的上调；尤以中TP组（16 ng/mL）的表达改动最显着。
本研讨标明TP可经过有用下降ILK表达，按捺ILK信号通路的活性，然后削减ILK参加其他诱导足细胞EMT信号通路的影响，进而下降MMP9的表达，保持足细胞基底膜的完整性，一起上调受高糖影响而被按捺的NEPH1表达。提示TP可经过调理ILK、MMP9和NEPH1表达来按捺足细胞受高糖诱导的EMT，然后维护高糖环境下受损的足细胞，削减蛋白尿的发作，推迟糖尿病肾病的发展。而本研讨提示以中剂量TP干涉效果最显着，并非呈剂量依赖性。高剂量TP的效果反而削弱，这是否与其细胞毒性有关，需要进一步研讨证明。
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（收稿日期：2016-07-11）
